ナノミセルを用いた腎糸球体細胞への治療的介入

近い将来臨床応用可能な腎臓特異的治療介入を確立することを目的とし、ナノミセルに薬剤を内包した新奇のドラッグデリバリーシステムを適用することとした本研究において、本年度は、ミセルの腎糸球体内での局在及び動態をより明らかにして糸球体細胞への導入効率の向上を図るとともに、ミセルに内包する物質を様々に選定してin vivo/in vitro両面からその薬効を検証した。1.ミセルの作製:片岡一則教授研究室より供与される高分子ナノミセルについては、第一世代よりも改良が加えられ、細胞内への取込み効率を増加させることが可能となった(細胞表面への接着を増すためにミセル表面に環状ペプチドを表出させるなど)。2.腎糸球体内局在の評価(in vivo):糸球体内特異的集積が観察されたラット糸球体組織標本を用いてメサンギウム細胞マーカーであるThy.1抗原に対する抗体による蛍光染色を行いミセル集積部位がメサンギウム領域に大いにオーバーラップすることを見出した。従って、予測どおりミセルは主としてメサンギウム細胞に取り込まれる可能性が高いと判断した。3.培養メサンギウム細胞への集積の評価(in vitro):ヒト及びマウス培養メサンギウム細胞を用いて細胞上清へ蛍光ミセルの添加を行い細胞内導入されることを蛍光顕微鏡により確認した。4.siRNAを用いた機能的介入実験:ヒト/マウスMAPK1 siRNA(既に他のcell lineにてknock down効果が確認済みの有効なsiRNA)を内包したミセルを作製し、ヒト又はマウス培養メサンギウム細胞に添加。24、36、48、72時間後にRNAを抽出し、RT(reverse transcription)後、real time PCR施行(ABI PRISM 7000使用)し、knock down効果を評価した。その結果、24時間〜48時間をピークに40〜50%程度のknock down効率をもって有意に抑制された。その他使用したsiRNAのうち有意差が得られたものはcolIのsiRNAであった。5.実験腎炎への治療的介入:上記4.においてsiRNAによるknock downが強力とは言い難いため、1.に示したようにミセルの改良によるさらなる導入効率の改善が必要となったため、現段階ではin vivoでのsiRNAミセル投与実験に着手出来ていない。近々に改良ミセルを用いた腎炎モデル動物への投与を予定している。

近い将来臨床応用可能な腎臓特異的治療介入を確立することを目的とし、ナノミセルに薬剤を内包した新奇のドラッグデリバリーシステムを適用することとした本研究において、本年度は、ミセルの腎糸球体内での局在及び動態をより明らかにして糸球体細胞への導入効率の向上を図るとともに、ミセルに内包する物質を様々に選定してin vivo/in vitro両面からその薬効を検証した。1.ミセルの作製:片岡一則教授研究室より供与される高分子ナノミセルについては、第一世代よりも改良が加えられ、細胞内への取込み効率を増加させることが可能となった(細胞表面への接着を増すためにミセル表面に環状ペプチドを表出させるなど)。2.腎糸球体内局在の評価(in vivo):糸球体内特異的集積が観察されたラット糸球体組織標本を用いてメサンギウム細胞マーカーであるThy.1抗原に対する抗体による蛍光染色を行いミセル集積部位がメサンギウム領域に大いにオーバーラップすることを見出した。従って、予測どおりミセルは主としてメサンギウム細胞に取り込まれる可能性が高いと判断した。3.培養メサンギウム細胞への集積の評価(in vitro):ヒト及びマウス培養メサンギウム細胞を用いて細胞上清へ蛍光ミセルの添加を行い細胞内導入されることを蛍光顕微鏡により確認した。4.siRNAを用いた機能的介入実験:ヒト/マウスMAPK1 siRNA(既に他のcell lineにてknock down効果が確認済みの有効なsiRNA)を内包したミセルを作製し、ヒト又はマウス培養メサンギウム細胞に添加。24、36、48、72時間後にRNAを抽出し、RT(reverse transcription)後、real time PCR施行(ABI PRISM 7000使用)し、knock down効果を評価した。その結果、24時間〜48時間をピークに40〜50%程度のknock down効率をもって有意に抑制された。その他使用したsiRNAのうち有意差が得られたものはcolIのsiRNAであった。5.実験腎炎への治療的介入:上記4.においてsiRNAによるknock downが強力とは言い難いため、1.に示したようにミセルの改良によるさらなる導入効率の改善が必要となったため、現段階ではin vivoでのsiRNAミセル投与実験に着手出来ていない。近々に改良ミセルを用いた腎炎モデル動物への投与を予定している。