RNAタグ法を用いたsmallRNAとRNA結合蛋白の分離法の開発

开发利用RNA标签法分离小RNA和RNA结合蛋白的方法

• 批准号: 19657043
• 负责人: 三戸部 治郎
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: National Institute of Infectious Diseases
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19657043/
• 关键词: RNA; クロスリンク; 赤痢菌; 転写後調節

モデルケースとして、当研究部門で解析中の、温度により発現が転写後制御される、赤痢菌の病原性プラスミド上の制御因子invE遺伝子の5'-non coding regionにboxB配列を導入した。この1コピーのboxB配列がinvEの発現制御に影響しないことを確認した後、InvE蛋白が転写後調節で抑制される30℃で培養し培養液にフォルマリンを終濃度1%に加えることで、タグの付加されたinvE-mRNAとその結合蛋白Hfqならびに未知の調節RNA分子クロスリンクさせた。この細胞抽出液にタグ配列に特異的に結合するビオチン付加λNペプチドを作用させ、目的とするRNA複合体をストレプトアビジン磁気ビーズで精製した。得られた複合体は70℃の熱処理で、クロスリンクによる共有結合を可逆的に外し、プロテアーゼKで処理して得られたsRNAをポリA化し、オリゴdTプライマーを用いてcDNAを合成し、pGEM-Tベクターにクローニングし、シーケンスを行った。多数シーケンスした結果、残念ながら全て16S並びに23Sリボゾームの断片配列が得られ、その理由として、機能的にリボゾームが結合した時点で翻訳が中断しているか、λNペプチドの認識する配列が甘いため、細胞内に多量に存在するリボゾームを非特異的に結合してしまう可能性が示唆された。後者の可能性を否定するため、染色体上のRNA結合蛋白Hfqにヒスチジンタグを付加し、フォルマリン処理後、Ni-NTAビーズでRNA-Hfq複合体を精製した後、λNペプチドで再抽出する系を作製し、解析中である。副次的ながらこの系を用いて、Hfqがin vivoでinvE-mRNAに結合していることを証明することが出来た。当初計画された、大腸菌の既知のmRNA-sRNAペアである鉄結合蛋白のsodB-mRNAに関しては上記理由から、invEの系で良好な結果が得られた場合に追試することとした。

モ デ ル ケ ー ス と し で て, when the department of parsing の, temperature に よ り 発 が now planning to write after the suppression さ れ る, dysentery bacteria の pathogenicity プ ラ ス ミ ド の on suppression factor invE heritage 伝 son の 5 '- non coding region に boxB match column を import し た. こ の 1 コ ピ ー の boxB match column が invE の 発 now suppression に influence し な い こ と を confirm し た, invE protein が after planning to write after adjusting で inhibit さ れ る 30 ℃ で cultivate し culture に フ ォ ル マ リ ン を final concentration 1% に え る こ と で, タ グ の plus さ れ た invE - mRNA と そ の binding protein Hfq な ら び に unknown <s:1> regulatory RNA molecule ロスリ ロスリ させた させた させた. こ の cell extract に タ グ match column に specific に combining す る ビ オ チ ン plus lambda N ペ プ チ ド を role さ せ, purpose と す る RNA complex を ス ト レ プ ト ア ビ ジ ン magnetic 気 ビ ー ズ で refined し た. Have ら れ た complex は 70 ℃ heat の 処 で, ク ロ ス リ ン ク に よ る mutual combination を reversible に し, プ ロ テ ア ー ゼ K で 処 Richard し て must ら れ た sRNA を ポ リ A し, オ リ ゴ dT プ ラ イ マ ー を with い て cDNA を synthetic し, pGEM - T ベ ク タ ー に ク ロ ー ニ ン グ し, シ ー ケ ン ス を line っ た. Most シ ー ケ ン ス し た results, the residual な が ら て all 16 s and び に 23 s リ ボ ゾ ー ム の fragment with column が have ら れ, そ の reason と し て, functional に リ ボ ゾ ー ム が combining し た point で turn 訳 が interrupt し て い る か, lambda N ペ プ チ ド の know す る match column が gump い た め, intracellular に に exist abundant す る リ ボ ゾ ー ム を に nonspecific In combination with て まう possibility が implication された. The latter possibility の を negative す る た め, chromosome の rna-binding protein Hfq に ヒ ス チ ジ ン タ グ を pay plus し, フ ォ ル マ リ ン 処 after, Ni - NTA ビ ー ズ で RNA - Hfq complex を refined し た, lambda N ペ プ チ ド で extracted す る を makes し, parsing で あ る. Pair of times な が ら こ の is を with い て, Hfq が in vivo で invE - mRNA に combining し て い る こ と を prove す る こ と が た. Original plan さ れ た, coliform の already know の mRNA - sRNA ペ ア で あ objects る iron binding protein の sodB - mRNA に masato し て は written reasons か ら, invE の で な good results ら が れ に た occasions after try す る こ と と し た.

项目成果

Molecular characterization of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 isolates dispersed across Japan by pulsed-field gel electrophoresis and multiple-locus variable-number tandem repeat analysis.

通过脉冲场凝胶电泳和多位点可变数量串联重复分析对散布在日本各地的肠出血性大肠杆菌 O157:H7 分离株进行分子表征。

• 发表时间: 2008
• 期刊: Jpn J Infect Dis 61
• 作者: Pei Y;Terajima J;Saito Y;Suzuki R;Takai N;Izumiya H;Morita-Ishihara T;Ohnishi M;Miura M;Iyoda S;Mitobe J;Wang B;Watanabe H.
• 通讯作者: Watanabe H.

Involvement of RNA-binding protein Hfq in the post-transcriptional regulation of invE gene expression in Shigella sonnei

• DOI: 10.1074/jbc.m710108200
• 发表时间: 2008-02-29
• 期刊: JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
• 影响因子: 4.8
• 作者: Mitobe, Jiro;Morita-Ishihara, Tomoko;Watanabe, Haruo
• 通讯作者: Watanabe, Haruo

食中毒予防必携第二版

预防食物中毒要点第二版

• 发表时间: 2007
• 作者: 三戸部 治郎;渡辺 治雄;他
• 通讯作者: 他

赤痢菌のType III secretion systemのPost-transcriptionalな温度、浸透圧制御

志贺氏菌 III 型分泌系统的转录后温度和渗透压控制

• 发表时间: 2008
• 作者: Mitobe J;Morita-Ishihara T;Ishihama A.;Watanabe H.
• 通讯作者: Watanabe H.

最新細菌・カビ・酵母図鑑

最新细菌、霉菌和酵母图解指南

• 发表时间: 2007
• 作者: Tanaka;H.;Tamai;E.;Miyata;S.;Taniguchi;Y.;Nariya;H.;Hatano;N.;Houchi H;Okabe;A;岡部 昭延
• 通讯作者: 岡部 昭延