多光子CALIとFRETを用いた生細胞内における蛋白質間相互作用の機能解析

使用多光子 CALI 和 FRET 对活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用进行功能分析

基本信息

  • 批准号:
    19657063
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 2.24万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Exploratory Research
  • 财政年份:
    2007
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2007 至 2008
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

細胞内のシグナル伝達には、蛋白質間相互作用が重要であり、蛋白質が他のどのような蛋白質と結合するかは、蛋白質の生体内での機能を理解するうえで必要不可欠である。蛋白質間相互作用を解析する方法の多くは、人工的な試験管内での蛋白質間相互作用の有無を調べることができても、生細胞内での生理的な相互作用を解析することは困難である。われわれは、培養細胞において機能分子を可視化しながら、その機能を任意の領域とタイミングで特異的に阻害することが可能な、多光子CALIを独自に開発した(Nature Methods2:503,2005)。一方、生細胞内での蛋白質間結合を画像化する方法として、FRET(Fluorescence resonance energy transfer:蛍光共鳴エネルギー移動)イメージングがある。本研究の目的は,生細胞内で、FRETイメージングにより蛋白質間結合を可視化同定し、それらの蛋白質複合体に対して、多光子CALIを行い、蛋白質複合体の機能を特異的に阻害することによって、蛋白質間相互作用の機能を解明する新たな方法を開発することである。蛋白質多量体モデルシステムとして、ギャップ結合細胞間コミュニケーション能を持たないHeLa細胞に、Cx43-EGFPとCx43-mRFPを発現させコミュニケーション能を獲得した細胞を作成した。コミュニケーション能の解析には、低分子量の蛍光色素の周辺細胞への色素の広がりによって評価する色素カップリング法を用いた。Cx43-EGFPとCx43-mRFPとの間で起るFRETの検出に成功した。Cx43-EGFPギャップ結合プラークに対する多光子CALIによって、ギャップ結合の機能を阻害できることを色素カップリング法によって証明した。
Intracellular の シ グ ナ ル 伝 da に は, protein interaction between が important で あ り, protein が he の ど の よ う な protein と combining す る か は, protein の born in vivo で の function を understand す る う え で need not owe で あ る. Protein interactions between を parsing す る method is の く は, artificial な test tube で の protein interaction between の presence of を adjustable べ る こ と が で き て も, intracellular で の physiological な interactions を parsing す る こ と は difficult で あ る. わ れ わ れ は, culture cell に お い て functional molecular を visualization し な が ら, そ の arbitrary function を の field と タ イ ミ ン グ で specific に resistance against す る こ と が may な, multiphoton CALI を に alone open 発 し た (Nature Methods2:503200 5). One party, intracellular で の combination between protein を portrait turn す る method と し て, FRET (Fluorescence resonance energy transfer: 蛍 resonance light エ ネ ル ギ ー mobile) イ メ ー ジ ン グ が あ る. は の purpose, this study で within living cells, FRET イ メ ー ジ ン グ に よ り combination between protein を visualization with し, そ れ ら の protein complex に し seaborne て, multiphoton CALI を い, protein complex の function を specific に resistance against す る こ と に よ っ て, protein interaction between の function を interpret す る new た な method を open 発 す る こ と Youdaoplaceholder0. Protein quantity body more モ デ ル シ ス テ ム と し て, ギ ャ ッ プ combination between cells コ ミ ュ ニ ケ ー シ ョ ン can を hold た な い HeLa に, Cx43 EGFP と Cx43 - mRFP を 発 now さ せ コ ミ ュ ニ ケ ー シ ョ ン can get し を を た cells into し た. Can コ ミ ュ ニ ケ ー シ ョ ン の parsing に は, low molecular weight の 蛍 photopigment の 辺 cell へ の pigment の hiroo が り に よ っ て review 価 す る pigment カ ッ プ リ ン を グ method using い た. Between Cx43-EGFPとCx43-mRFPと と で るFRET 検 に に successful た た た. Cx43 - EGFP ギ ャ ッ プ combining プ ラ ー ク に す seaborne る multiphoton CALI に よ っ て, ギ ャ ッ プ combined function of の を resistance against で き る こ と を pigment カ ッ プ リ ン グ method に よ っ て prove し た.

项目成果

期刊论文数量(12)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
多光子CALIによる内在性コネキシンの機能阻害条件の検討
多光子 CALI 抑制内源性连接蛋白功能的条件研究
  • DOI:
  • 发表时间:
    2007
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    山岡 禎久;戴 平;人見 敏明;田中 秀央;小山田 正人;高松 哲郎
  • 通讯作者:
    高松 哲郎
Beneficial effects of connexin43 knockdown on wound healing after corneal endothelial injury in vivo : Acceleration of wound closure and inhibition of mesenchymal transition
connexin43 敲低对体内角膜内皮损伤后伤口愈合的有益作用:加速伤口闭合和抑制间质转化
  • DOI:
  • 发表时间:
    2008
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    Oyamada M;Nakano Y;Dai P;Nakagami T;Kinoshita S;Takamatsu T
  • 通讯作者:
    Takamatsu T
Connexin43 knockdown accelerates wound healing but inhibits mesenchymal transition after corneal endothelial injury in vivo
梗塞心における細胞間コミュニケーション-非心筋細胞に注目して-
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  • DOI:
  • 发表时间:
    2007
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    小山田 正人;谷口 大吾;藤原 克次;中上 拓男;原田 義規;田中 秀央;高松 哲郎
  • 通讯作者:
    高松 哲郎
Connexin43の人為的発現調節は角膜内皮細胞の創傷治癒に重大な影響を及ぼす
人工调控Connexin43表达对角膜内皮细胞伤口愈合有显着影响
  • DOI:
  • 发表时间:
    2008
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    小山田正人;中野由起子;戴平;中上拓男;高松哲郎
  • 通讯作者:
    高松哲郎
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    高松 哲郎
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    0
  • 作者:
    小山田 正人;高松 哲郎
  • 通讯作者:
    高松 哲郎
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  • DOI:
  • 发表时间:
    2007
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    0
  • 作者:
    田中 秀央;小山田 正人;辻井 英治;万井 弘基;中上 拓男;藤原 克次;高松 哲郎
  • 通讯作者:
    高松 哲郎

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