多光子CALIとFRETを用いた生細胞内における蛋白質間相互作用の機能解析

細胞内のシグナル伝達には、蛋白質間相互作用が重要であり、蛋白質が他のどのような蛋白質と結合するかは、蛋白質の生体内での機能を理解するうえで必要不可欠である。蛋白質間相互作用を解析する方法の多くは、人工的な試験管内での蛋白質間相互作用の有無を調べることができても、生細胞内での生理的な相互作用を解析することは困難である。われわれは、培養細胞において機能分子を可視化しながら、その機能を任意の領域とタイミングで特異的に阻害することが可能な、多光子CALIを独自に開発した(Nature Methods2:503,2005)。一方、生細胞内での蛋白質間結合を画像化する方法として、FRET(Fluorescence resonance energy transfer:蛍光共鳴エネルギー移動)イメージングがある。本研究の目的は,生細胞内で、FRETイメージングにより蛋白質間結合を可視化同定し、それらの蛋白質複合体に対して、多光子CALIを行い、蛋白質複合体の機能を特異的に阻害することによって、蛋白質間相互作用の機能を解明する新たな方法を開発することである。蛋白質多量体モデルシステムとして、ギャップ結合細胞間コミュニケーション能を持たないHeLa細胞に、Cx43-EGFPとCx43-mRFPを発現させコミュニケーション能を獲得した細胞を作成した。コミュニケーション能の解析には、低分子量の蛍光色素の周辺細胞への色素の広がりによって評価する色素カップリング法を用いた。Cx43-EGFPとCx43-mRFPとの間で起るFRETの検出に成功した。Cx43-EGFPギャップ結合プラークに対する多光子CALIによって、ギャップ結合の機能を阻害できることを色素カップリング法によって証明した。

細胞内のシグナル伝達には、蛋白質間相互作用が重要であり、蛋白質が他のどのような蛋白質と結合するかは、蛋白質の生体内での機能を理解するうえで必要不可欠である。蛋白質間相互作用を解析する方法の多くは、人工的な試験管内での蛋白質間相互作用の有無を調べることができても、生細胞内での生理的な相互作用を解析することは困難である。われわれは、培養細胞において機能分子を可視化しながら、その機能を任意の領域とタイミングで特異的に阻害することが可能な、多光子CALIを独自に開発した(Nature Methods2:503,2005)。一方、生細胞内での蛋白質間結合を画像化する方法として、FRET(Fluorescence resonance energy transfer:蛍光共鳴エネルギー移動)イメージングがある。本研究の目的は,生細胞内で、FRETイメージングにより蛋白質間結合を可視化同定し、それらの蛋白質複合体に対して、多光子CALIを行い、蛋白質複合体の機能を特異的に阻害することによって、蛋白質間相互作用の機能を解明する新たな方法を開発することである。蛋白質多量体モデルシステムとして、ギャップ結合細胞間コミュニケーション能を持たないHeLa細胞に、Cx43-EGFPとCx43-mRFPを発現させコミュニケーション能を獲得した細胞を作成した。コミュニケーション能の解析には、低分子量の蛍光色素の周辺細胞への色素の広がりによって評価する色素カップリング法を用いた。Cx43-EGFPとCx43-mRFPとの間で起るFRETの検出に成功した。Cx43-EGFPギャップ結合プラークに対する多光子CALIによって、ギャップ結合の機能を阻害できることを色素カップリング法によって証明した。