多光子顕微鏡を用いた細胞内小器官レベルのナノサージェリー

使用多光子显微镜进行亚细胞细胞器水平的纳米外科手术

• 批准号: 14657059
• 负责人: 小山田 正人
• 金额: $ 2.05万
• 依托单位: Kyoto Prefectural University of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14657059/
• 关键词: 多光子顕微鏡; ナノテクノロジー; レーザー顕微鏡; 細胞小器官; 非線形工学; ナノサージェリー; カルシウム波; 非線形光学; 小胞体

本研究の目的は,多光子レーザー顕微鏡を用いて,生細胞でミトコンドリアなどの細胞小器官を1個のレベルで制御するナノサージェリー法を開発することである。この目的を達成するため、以下の2つの実験を行った。1.生細胞における単一ミトコンドリアの制御生細胞における個々のミトコンドリアを可視化するため、蛍光蛋白質DsRed2にミトコンドリアターゲットシグナルを付加した遺伝子発現ベクターをHeLa細胞にトランスフェクトした。最初に、モードロックチタンサファイアレーザー(Mai-Tai,パルス幅100フェムト秒,中心波長780-850nm)を用いて、波長780nm,NDフィルター透過率10%で、個々のミトコンドリアが識別可能な画像を得た。この条件では、ミトコンドリアの蛍光強度は、ほとんど変化しないことを確認した。引き続いて、NDフィルター透過率40%として、照射するレーザーパワーを上げ、slowスキャンスピードで1回、単一のミトコンドリアのみにレーザー光を照射した。再び、NDフィルター透過率10%でミトコンドリアの蛍光像をイメージングすることにより、NDフィルター透過率40%で照射した単一のミトコンドリアの蛍光のみが特異的に消失し、周辺の他のミトコンドリアには影響を与えないことが確認された。以上の結果は、多光子レーザー顕微鏡を用いることにより,生細胞でミトコンドリア1個のレベルで制御するナノサージェリー法が可能であることを示した。2.多光子レーザー顕微鏡を用いた生細胞における蛋白質複合体形成の可視化Green fluorescent protein(GFP)とmonomeric red fluorescent protein(mRFP)を用いて、多光子吸収反応によって、GFPからmRFPへのfluorescent energy resonance transfer(FRET)を検出し、生細胞で蛋白質複合体形成の可視化に成功した。この結果は、複合体を形成する蛋白質について、多光子反応を用いた生細胞内制御の可能性を示す。

は の purpose, this study multiphoton レ ー ザ ー 顕 micromirror を with い て, living cells で ミ ト コ ン ド リ ア な ど の cell 1 small organs を の レ ベ ル で す system initiates a る ナ ノ サ ー ジ ェ リ ー method を open 発 す る こ と で あ る. The objective of を is to achieve するため, and the following <s:1> 2 actual experience を is to conduct った. 1. Living cells に お け る 単 a ミ ト コ ン ド リ ア の suppression living cells に お け る a 々 の ミ ト コ ン ド リ ア を visualization す る た め, 蛍 light protein DsRed2 に ミ ト コ ン ド リ ア タ ー ゲ ッ ト シ グ ナ ル を plus し た posthumous son 伝 発 now ベ ク タ ー を HeLa に ト ラ ン ス フ ェ ク ト し た. Initial に, モ ー ド ロ ッ ク チ タ ン サ フ ァ イ ア レ ー ザ ー (Mai Tai, パ ル ス 100 フ ェ ム ト seconds, center wavelength 780-850 nm) を with い て, wavelength of 780 nm, ND フ ィ ル タ ー transmittance 10% で, a 々 の ミ ト コ ン ド リ ア が recognition may な portrait を た. <s:1> <s:1> conditions で た, トコ ドリア ドリア ドリア 蛍 蛍 light intensity <e:1>, ほとん <s:1> variation <s:1> な とを とを confirm た た. Lead き 続 い て, ND フ ィ ル タ ー transmittance 40% と し て, illuminate す る レ ー ザ ー パ ワ ー を げ, missile ス キ ャ ン ス ピ ー ド で 1, 単 back の ミ ト コ ン ド リ ア の み に レ ー ザ ー を sunlight し た. び again, ND フ ィ ル タ ー transmittance 10% で ミ ト コ ン ド リ ア の 蛍 light like を イ メ ー ジ ン グ す る こ と に よ り, ND フ ィ ル タ ー transmittance 40% で irradiation し た 単 a の ミ ト コ ン ド リ ア の 蛍 light の み が specific に disappear し, zhou 辺 の he の ミ ト コ ン ド リ ア に は influence を and え な い こ と が confirm さ れ た. の above results は, multiphoton レ ー ザ ー 顕 micromirror を with い る こ と に よ り, living cells で ミ ト コ ン ド リ ア 1 の レ ベ ル で す system initiates a る ナ ノ サ ー ジ ェ リ が ー method may で あ る こ と を shown し た. 2. Multi-photon レ ザ 顕 顕 micromirror を formation of <s:1> visualized Green fluorescent protein(GFP)とmonomeric red fluorescent using <s:1> た biological cell における protein complexes Protein (mRFP) を い て, multiphoton absorption 収 anti 応 に よ っ て, GFP か ら mRFP へ の fluorescent energy resonance transfer (FRET) を 検 し, living cells で protein complex formation の visualization に successful し た. The result of <s:1>, the complex を forms する protein に を て て て, and the multi-photon anti応 を uses た た た to create the possibility of intracellular control of <s:1> を indicates す.

项目成果

Hirakawa, H. et al.: "Regional differences in blood-nerve barrier function and light-junction protein expression with the rat dorsal root ganglion"NeuroReport. 15. 405-408 (2004)

Hirakawa, H. 等人：“大鼠背根神经节血神经屏障功能和光连接蛋白表达的区域差异”NeuroReport。

小山田正人, 小山田ゆみ子: "病気と小器官(森道夫編) ギャップ結合チャネル病-細胞社会のネットワーク障害-"文光堂. 236 (2002)

Masato Oyamada、Yumiko Oyamada：“疾病和小器官（由 Michio Mori 编辑）间隙连接通道疾病 - 细胞协会的网络疾病”Bunkodo 236（2002）。

Oyamada Y., et al.: "Dominant-negative connexin43-EGFP inhibits calcium-transient synchronization of primary neonatal rat cardiomyocytes."Exp.Cell Res.. 273. 85-94 (2002)

Oyamada Y. 等人：“显性阴性连接蛋白 43-EGFP 抑制原代新生大鼠心肌细胞的钙瞬时同步。”Exp.Cell Res.. 273. 85-94 (2002)

小山田ゆみ子, 他: "心筋症の遺伝子異常と病態発生"病理と臨床臨時増刊号『病理診断における分子生物学』. (印刷中). (2004)

Yumiko Oyamada 等人：“心肌病的遗传异常和发病机制”病理学和临床特刊“病理诊断中的分子生物学”（印刷中）。

Tsujii, E., et al.: "In situ visualization of the intracellular Ca2+ dynamics at the border of the acute myocardial infarction"Mol.Cell. Biochem.. (印刷中).

Tsujii, E., 等人：“急性心肌梗塞边界细胞内 Ca2+ 动态的原位可视化”Mol.Cell.（出版中）。