多光子顕微鏡を用いた細胞内小器官レベルのナノサージェリー

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本研究の目的は,多光子レーザー顕微鏡を用いて,生細胞でミトコンドリアなどの細胞小器官を1個のレベルで制御するナノサージェリー法を開発することである。この目的を達成するため、以下の2つの実験を行った。1.生細胞における単一ミトコンドリアの制御生細胞における個々のミトコンドリアを可視化するため、蛍光蛋白質DsRed2にミトコンドリアターゲットシグナルを付加した遺伝子発現ベクターをHeLa細胞にトランスフェクトした。最初に、モードロックチタンサファイアレーザー(Mai-Tai,パルス幅100フェムト秒,中心波長780-850nm)を用いて、波長780nm,NDフィルター透過率10%で、個々のミトコンドリアが識別可能な画像を得た。この条件では、ミトコンドリアの蛍光強度は、ほとんど変化しないことを確認した。引き続いて、NDフィルター透過率40%として、照射するレーザーパワーを上げ、slowスキャンスピードで1回、単一のミトコンドリアのみにレーザー光を照射した。再び、NDフィルター透過率10%でミトコンドリアの蛍光像をイメージングすることにより、NDフィルター透過率40%で照射した単一のミトコンドリアの蛍光のみが特異的に消失し、周辺の他のミトコンドリアには影響を与えないことが確認された。以上の結果は、多光子レーザー顕微鏡を用いることにより,生細胞でミトコンドリア1個のレベルで制御するナノサージェリー法が可能であることを示した。2.多光子レーザー顕微鏡を用いた生細胞における蛋白質複合体形成の可視化Green fluorescent protein(GFP)とmonomeric red fluorescent protein(mRFP)を用いて、多光子吸収反応によって、GFPからmRFPへのfluorescent energy resonance transfer(FRET)を検出し、生細胞で蛋白質複合体形成の可視化に成功した。この結果は、複合体を形成する蛋白質について、多光子反応を用いた生細胞内制御の可能性を示す。