遺伝子工学を用いた脳内摂食調節ニューロンネットワーク解析法の開発

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本年度はGALP遺伝子転写調節領域の下流にCreリコンビナーゼとタモキシフェン受容体融合タンパク質cDNAを導入したDNAコンストラクトを用いたトランスジェニックマウスの作出を行った。トレーサーとなる蛍光タンパク質を細胞中に高発現させるためにCre-loxPシステムを用いた。これは蛍光タンパク質の発現が目的となる遺伝子のプロモーター活性に依存することなく、強力なプロモーター活性をもつCAGプロモーターによって転写調節をうけるので、トレーサーの発現量は顕著に増大した。GALP mRNA発現は、生後14日目以降に発現することが言われているが、発生期あるいは胎生期に発現するかどうかは不明である。成体におけるニューロンネットワークを可視化することを目的とするので、発生期や胎生期にはトレーサーとなる蛍光タンパク質の発現を抑制しておかなければならない。そこでタモキシフェン(エストロゲン誘導体)特異的に結合するエストロゲン変異受容体とCreリコンビナーゼとの融合タンパク質にすることで、タモキシフェンが結合するまではCreリコンビナーゼは活性化しないというメリットがあるので、時間的にCreリコンビナーゼの活性化を調節した。GALP遺伝子の転写調節領域がどこにあるのか不明なため、GALP遺伝子が導入されているBAC(バクテリア人工染色体)クローンを用いた。Cre-タモキシフェン受容体cDNAを、そのBACクローンに導入した。BACクローン内で相同組換えを起こさせ、組み換わった8ACを調製し、これを受精卵へのインジェクション用のサンプルとした。肥満研究で主に使われている系統であるC57BL/6Jの受精卵へDNAを注入してトランスジェニックマウスの作出に成功した。さらにこのマウスを用いてCreリコンビナーゼが認識するloxP配列導入トランスジェニックマウスの作出にも成功した。