特発性心室細動における心筋NO合成酵素の役割

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A、器質的心疾患を有さない心室細動発症者の遺伝子型解析昨年度、特発性心室細動の患者20名を同定し、倫理委員会の許可を得た研究様式によりDNA検体を採取した。本年度はAcetylcholine受容体とその調節分子群、またNO合成酵素遺伝子群とNO合成酵素機能関連遺伝子群の遺伝子型を検討した。Acetylcholine受容体のうちムスカリン受容体2型遺伝子CHRM2、NO合成酵素遺伝子のうちnNOS遺伝子NOS1ならびにeNOS遺伝子NOS3、NO合成酵素機能関連遺伝子群のうちカベオリン1遺伝子CAV1に関して遺伝型を直接シークエンス法にて検討した。いずれの遺伝子においても翻訳領域の塩基配列に異常を認めなかった。昨年度の結果と合わせると、特発性心室細動において心筋Naチャンネル遺伝子SCN5Aの貢献が明らかであるが、それ以外の他の遺伝子の貢献に関しては明らかでなかった。B、培養心筋細胞モデルでの遺伝子抑制新生マウス心筋細胞の初代培養に関して約4週間にわたる継続培養システムを樹立した。出生直後の胎児マウスより心室筋を取り出し、鑷子にて機械的に心筋細胞を単離し、プラスティックディッシュへの接着性にて心筋細胞を分離した。約4週間にわたっての培養は可能であった。マウス心筋イオンチャンネル遺伝子であるKcnql Scn5a特異的siRNAベクターを設計・合成した。培養心筋細胞へのsiRNAの導入条件に関して検討した。まずはじめの24時間にリポフェクタミンを含んだ培養液にて培養を行い、その後、それぞれのリポフェクタミンに混合したsiRNA入り培養液にて24時間培養を行い、48時間後にsiRNAの効果に関して定量的PCRならびにImmunoblottingを行った。定量的PCRでは100%のmRNAの抑制を認め、Immunoblottimgでは約20%への蛋白発現量の低下を認めた。この実験系にて安定した遺伝子抑制効果の検討が可能となった。