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脂肪細胞から核の初期化を経て誘導した軟骨細胞による軟骨修復

通过核重编程从脂肪细胞诱导软骨细胞修复软骨

基本信息

批准号：
19659378
负责人：
妻木範行
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

軟骨特異的発現をもたらすXI型コラーゲンα2鎖遺伝子(Collla2)のpromoter/enhancer配列にLacZとネオマイシン耐性遺伝子の融合遺伝子であるβgeo遺伝子を結合したトランスジーンコンストラクトを作製した。これを導入したトランスジェニックマウスを作製し、ラインを樹立した。このマウスの胎仔をX-galで染色すると、四肢と肋骨の軟骨原基のみが青く染まり、軟骨特異的にトランスジーンを発現していることが示唆された。このマウスの皮膚から線維芽細胞を、軟骨から軟骨細胞を初代培養した。培養にG418を添加すると、線維芽細胞は死滅したのに対し、軟骨細胞は生存した。Wild typeマウスから培養した軟骨細胞は死滅した。マウス培養軟骨細胞からRNAを抽出してcDNAを用意レトロウイルス発現ベクターに組み込んだcDNAライブラリーを作成した。このライブラリーをβgcoトランスジェニックマウス由来線維芽細胞細胞に導入したところ、G418耐性のコロニーは得られなかった。そこで初期化因子(c-Myc, Klf4, 0ct3/4, Sox2)とSOX9、SOX5、SOX6のcDNAをレトロウイルスベクターに組み込んで発現ベクターを川意した。これらを線維芽細胞に導入し、細胞から蛋白を抽出し、western blot解析を行った。各初期化因子とSOX9の抗体を用いたところ、バンドを認めたため、発現ベクターが機能していることが判明した。初期化因子、SOX9と軟骨cDNAライブラリーを種々の割合で混合して、線維芽細胞に導入したところ、コロニーが出現した。このコロニーをピックアップし、クローニングした。クローニングした細胞はalcian blueに染まり、軟骨の表現型を持つことが示唆された。この細胞の解析を進めるために、細胞からRNAと蛋白を抽出した、本年度の研究により、Collla2-βgeoトランスジェニックマウスとレトロウイルス発現ベクターを組み合わせて用いることにより、線維芽細胞を軟骨細胞に誘導し得ることが示唆された.

The promoter/enhancer of the bone trait was divided into two groups: LacZ, β-geo, fusion, fusion and fusion. I don't know what to do, and I don't know what to do. The fetus was stained with X-gal, the ribs of the limbs, the bone primordia, the bone, the bone and the bone. The first generation of bone cells were cultured in the first generation. Culture G418 to add cuttings, line maintenance germ cells, dead cells, and bone cells. Wild type cells are dead because they are dead. The RNA is extracted from the bone tissue. The cDNA is intended to induce the formation of the bone tissue. The cDNA is the best. The reason for this is that the germ cells are introduced into the bacteria, and the G418 tolerance test is successful. Primary factors (c-Myc, Klf4, 0ct3/4, Sox2): SOX9, SOX5, SOX6