グリセロアルデヒド3燐酸脱水素酵素のリガンド結合協同性の解析

三磷酸甘油醛脱氢酶配体结合协同性分析

• 批准号: 01480060
• 负责人: 太田 隆久
• 金额: $ 4.22万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
• 财政年份: 1989
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1989 至 1990
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-01480060/
• 关键词: アロステリック; リガンド結合; 協同性; オリゴマ-酵素; 耐熱性

昨年度において高度好熱性細菌のグリセロアルデヒド3燐酸脱水素酵素(GAPDH)の大量発現系を確立して大腸菌で生産させた酵素について部位特異的異変を導入して解析したが、この酵素の高度な安定性のために、そのままでは、所期の目的を達成するのが困難であった。そこで先ず、ビフィズス菌のLー乳酸脱水素酵素(LDH)を用いてリガンド結合協同性のモデル実験を試みた。本酵素は高度好熱性細菌の酵素より安定度は低いが、中温菌酵素としてはかなり高い安定性を有し、またクロ-ニンングした遺伝子が大腸菌中で良好な発現をする点で有利である。また、基質およびアロステリックエフェクタ-であるフルクト-ス1,6-二燐酸により酵素に正の協同性を生ずることから、グリセロアルデヒド3燐酸脱水素酵素の負の協同性と対象的なモデルとなるためである。リガンド結合性を変化させたLDHサブユニットのハイブリッドの分離を行うために酵素蛋白質のC末端に正および負の電荷のアミノ酸残基を導入した変異株を作成した。これら変異株およびそれを用いて大腸菌中で作成したサブユニットハイブリッドはHPLにより分離された。一方、リガンド結合性について基質ピルビン酸に対する認識をオキザロ酢酸にかえた変異、あるいはフルクト-ス1,6-二燐酸の結合性を無くした変異をもつサブユニットを作成し、上記変異との複合変異株によりリガンド結合性の異なるサブユニットのハイブリッド酵素の特性を解析した。この解析により、正のリガンド結合協同性はアロステリック現象の協奏型モデルに適合することを分子的に証明した。このモデル実験によりグリセロアルデヒド3燐酸デヒドロゲナ-ゼの負の協同性についても解析が行える見通しが得られた。

Yesterday's annual に お い て highly thermophilic bacteria の グ リ セ ロ ア ル デ ヒ ド 3 燐 acid dehydration vegetable enzyme (GAPDH) の large 発 now を establish し て coliform で production さ せ た enzyme に つ い て site specific vision - を import し て parsing し た が, こ の highly な の enzyme stability の た め に, そ の ま ま で は, the purpose of the phase is の を reached す る の が difficult Youdaoplaceholder0. そ こ で ず first, ビ フ ィ ズ ス bacteria の ー L lactic acid dehydration vegetable enzyme (LDH) を い て リ ガ ン ド combining collaborative の モ デ ル be 験 を try み た. This enzyme は highly の thermophilic bacteria enzyme よ り stability degree low は い が, medium temperature bacteria enzyme と し て は か な り い high stability を し, ま た ク ロ - ニ ン ン グ し た heritage 伝 child が coliform で good な 発 now を す る point で favorable で あ る. ま た, matrix お よ び ア ロ ス テ リ ッ ク エ フ ェ ク タ - で あ る フ ル ク ト ス 1, 6-2 燐 acid に よ に り enzyme is の collaborative を raw ず る こ と か ら, グ リ セ ロ ア ル デ ヒ ド 3 燐 acid dehydration vegetable enzyme の negative の collaborative と like the seaborne な モ デ ル と な る た め で あ る. リ ガ ン ド associativity を variations change さ せ た LDH サ ブ ユ ニ ッ ト の ハ イ ブ リ ッ ド の separation line を う た め に enzyme protein is の C terminal に お よ び negative charge の の ア ミ ノ acid residues を import し た - different strains を made し た. The <s:1> れら variant strains およびそれを were isolated from で of <s:1> て esiform bacteria to make <s:1> たサブユニットハ ブリッド ブリッド ブリッド HPLによ によ された された. Party, リ ガ ン ド associativity に つ い て matrix ピ ル ビ ン acid に す seaborne る know を オ キ ザ ロ boggy acid に か え た - vision, あ る い は フ ル ク ト ス 1, 6 - two 燐 acid の associative を く し た - different を も つ サ ブ ユ ニ ッ ト を make し, written - different と の compound - different strains に よ り リ ガ ン ド associativity の different な る サ ブ ユ ニ ッ ト の ハ イ ブ リ ッ Youdaoplaceholder0 enzyme characteristics を analysis た た. こ の parsing に よ り, is の リ ガ ン ド combining collaborative は ア ロ ス テ リ ッ ク phenomenon の kanadeai type モ デ ル に suitable す る こ と を molecular に prove し た. こ の モ デ ル be 験 に よ り グ リ セ ロ ア ル デ ヒ ド 3 燐 acid デ ヒ ド ロ ゲ ナ - ゼ の negative の collaborative に つ い て も parsing line が え る see tong し が must ら れ た.