グリセロアルデヒド3燐酸脱水素酵素のリガンド結合協同性の解析

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昨年度において高度好熱性細菌のグリセロアルデヒド3燐酸脱水素酵素(GAPDH)の大量発現系を確立して大腸菌で生産させた酵素について部位特異的異変を導入して解析したが、この酵素の高度な安定性のために、そのままでは、所期の目的を達成するのが困難であった。そこで先ず、ビフィズス菌のLー乳酸脱水素酵素(LDH)を用いてリガンド結合協同性のモデル実験を試みた。本酵素は高度好熱性細菌の酵素より安定度は低いが、中温菌酵素としてはかなり高い安定性を有し、またクロ-ニンングした遺伝子が大腸菌中で良好な発現をする点で有利である。また、基質およびアロステリックエフェクタ-であるフルクト-ス1,6-二燐酸により酵素に正の協同性を生ずることから、グリセロアルデヒド3燐酸脱水素酵素の負の協同性と対象的なモデルとなるためである。リガンド結合性を変化させたLDHサブユニットのハイブリッドの分離を行うために酵素蛋白質のC末端に正および負の電荷のアミノ酸残基を導入した変異株を作成した。これら変異株およびそれを用いて大腸菌中で作成したサブユニットハイブリッドはHPLにより分離された。一方、リガンド結合性について基質ピルビン酸に対する認識をオキザロ酢酸にかえた変異、あるいはフルクト-ス1,6-二燐酸の結合性を無くした変異をもつサブユニットを作成し、上記変異との複合変異株によりリガンド結合性の異なるサブユニットのハイブリッド酵素の特性を解析した。この解析により、正のリガンド結合協同性はアロステリック現象の協奏型モデルに適合することを分子的に証明した。このモデル実験によりグリセロアルデヒド3燐酸デヒドロゲナ-ゼの負の協同性についても解析が行える見通しが得られた。