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ウシキモシンおよびムコ-ルレンニンの蛋白工学的研究

牛凝乳酶和毛霉凝乳酶的蛋白质工程研究

基本信息

批准号：
02454062
负责人：
別府輝彦
金额：
$ 4.22万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至 1991
项目状态：
已结题

项目摘要

まず、第一にムコ-ルレンニンの酵素活性に重要な機能を果たすと思われるTyr75について新たに2種類の変異酵素を加え、合計17種類の変異酵素を取得した。部分的に配列を変えた9種類の合成基質に対して、活性を持つ2種類の変異型酵素(Y75N及びY75F)と無変異型酵素を用いて反応速度論的解析を行ったところ、変異型酵素は同様に無変異型酵素に比べてkcat/kmが大幅に低下していた。また、活性のないY75S変異型酵素を用いて基質類似の特異的阻害剤ペプスタチントの相互作用を解析したところ、無変異型酵素と同様に基質と1対1で結合していることが明らかになった。以上の結果より、75番部位は従来考えられていた基質認識を担うというよりも酵素ー基質複合体の反応遷移状態の安定化に寄与していると考えられた。次に、第二に基質と広く結合していると予想される部位の改変について行った。新たに10種の変異酵素を加え、合成17種の変異酵素を取得した。活性中心から遠いS3サブサイトのE13Qで、kcat/Kmが低下していた。以上得られたムコ-ルレンニンの変異酵素のうち、Y75N,E12T,F220E,F200Lでは耐熱性が低下しており、さらにY75Nでは凝乳活性とプロテア-ゼ活性の比の値が上昇するなど、実用上好ましい性質を示す改良を行うことに成功した。最後に第三にプロキモシンのリフォ-ルデイングにおいてN末アミノ酸の重要性について検討した。トリプトファンリ-ダ-ペプチドを持つCR601のリフォ-ルデイングには酸性アミノ酸の導入が効果的であった知見から、本来のN末を持つCR712の1番目のアミノ酸に酸性アミノ酸を導入した(A1E)ところ、変換効率は一段階透析において1.5倍に上昇したが、多段階透析では逆に2/3に低下した。一方、CR712の2番目の酸性アミノ酸を除去する(E21、E2K)と変換効率は透析の方法とは関係なく低下することから、本来ある酸性アミノ酸がリフォ-ルデイング過程に重要な働きを担っていることが示された。

Enzyme activity is very important because of the importance of enzyme activity. in addition, a total of 17 enzymes have been obtained through the addition of Tyr75 enzymes. Some of them are equipped with different synthetic enzymes, active isozymes (Y75N and Y75F). By using the analysis of the inverse speed theory, they are much lower than those of kcat/km. Isozymes, active enzymes, Y75S enzymes, enzymes The results of the above results, 75 times of the results of the above results, the results of the above results, 75 times of the above results, the results of the above results and 75 parts of the results show that the complex of enzymes and enzymes in the above results have been sent to the laboratory. The second and second basic information is combined with the information that you want to change the location of the machine to change the position. The addition of 10 kinds of enzymes and the synthesis of 17 kinds of enzymes were obtained. The active center, S3, E13Q, kcat/Km, low temperature, low temperature, low temperature. The above results are as follows: Y75NMagi E12T, F220E, F200L, low tolerance, low endurance, low endurance, low At the end of the day, there is no question of the importance of acid in the end. In the first place, I was told that I was aware of the acid in the fruit. I was supposed to know that the acid in the fruit was not in the first place. In the end, I used to know that the acid in the fruit was not in the first place. I would like to know that in the end of the day, I would like to know that in the end of the day, I would like to know that I am not aware of the acid in the fruit. I would like to know that in the end of the CR712, I would like to know that the acid is not acidic in the first place. I would like to know that in the end of the CR712, I would like to know that the acid is not acidic. Multi-stage dialysis, reverse dialysis, reverse dialysis, low hemodialysis, reverse dialysis, low dialysis, low dialysis. On the one hand, CR712 (E21, E2K) acid removal rate, dialysis method, acid concentration, pH, acid, amino acid, acid, acid,