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線虫C.elegansの胚発生各期に特異的に発現される遺伝子群の解析

线虫胚胎发育各阶段特异表达基因分析

基本信息

批准号：
02454557
负责人：
小原雄治
金额：
$ 4.42万
依托单位：
National Institute of Genetics
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-02454557/
关键词：
mRNA 胚発生 cDNA PCR in situハイブリダイゼーションハイブリダイゼ-ション YAC 遺伝子発現

项目摘要

細胞間でのdefferentialスクリーニングの試みのひとつとして、初期胚の割球間で遺伝子発現量の比較をおこなった。まず、2〜4細胞期の割球の分離法を確立した。親虫をアルカリブリーチ処理して初期胚を得、卵殻が非常に固いのでキチナーゼ処理した後、浸透圧を調節した緩衝液中でマイクロマニピュレーターを用いて、ガラス針で物理的に分離した。まず、AB、P1の各前後単一割球およびコントロールとして後期胚から核酸を抽出し、PCR法を応用した全cDNA種の増幅をおこなった。増幅cDNAの質を検討するために、卵から初期胚でのみmRNAが検出される母性遺伝子glp‐1、fem‐3、後期胚から発現が見られる咽頭筋遺伝子myo‐2の存在を調べたところ、AB、P1割球由来増幅cDNAともglp‐1、fem‐3が存在したが、myo‐2はバックグランドレベルであった。一方、後期胚由来cDNAは逆の結果となり、増幅したcDNAが元の組成を反映していることが裏付けられた。そこで、各割球由来増幅cDNAをプローブとして、線虫初期胚集団から通常の方法で作成したcDNAライブラリーのスクリーニングをおこなった。約5x10^5クローンをスクリーニングした結果、比較的強いシグナルを与えるものとして、前割球(AB)特異的なものを3種類7クローン、後割球(P1)特異的なものを1クローン、分離した。各クローンの解析は現在進行中である。mRNAの極在を確かめるために、胚でのin situハイブリダイゼーション法を検討した。卵殻の除去、ヴィテリン膜の除去、形態維持のための浸透圧調整、などをおこない、中期胚以降については成功したが、初期胚については、大量の卵黄タンパクの存在によるバックグランドの高さなどのためさらに検討を重ねている。

でのdeferential between cells でクリーニングのtest みのひとつとして, early embryo のcut ball between で伝子発现quantity をおこなった. The separation method of cutting balls at the 2- to 4-cell stage has been established. After the parent insect has been treated with the してブリーチ, the early embryo is obtained, the egg shell is very solid, and the いのでキチナーゼ treatment is done, soaked To adjust the pressure of the buffer solution, use a いて or ガラス needle to physically separate the でマイクロマニピュレーターを.まず, AB, P1のeach front and rear single cut ballおよびコントロールとしてlater embryoかThe nucleic acid is extracted and the PCR method is used to amplify the whole cDNA species. Amplify the quality of cDNA and increase the quality of cDNA and the early embryo of egg and mRNA.るMaternal leftover glp-1, fem-3, late embryonic stage The origin of myo-2's presence, AB, and P1 cut balls, amplification of cDNA and glp ‐1, fem‐3 exists, myo‐2 exists. On the one hand, the origin of late-stage embryos is the reverse result of cDNA, and the composition of cDNA in the extended period is reflected in the result.そこで, each cut ball origin amplified cDNA をプローブとして, nematode early embryo collection 団から通The usual method is to create a cDNA file. About 5x10^5 クローンをスクリーニングした result, comparison of strong いシグナルを and えるものとして, front cut The ball (AB)-specific Nana 3 types 7クローン, the post-cut ball (P1)-specific Nanaを1クローン, and the separationした. The analysis of each クローンの is currently in progress. The essence of mRNA is the same as that of the embryo. Egg shell removal, ヴィテリンmembrane removal, morphological maintenance and infiltration pressure adjustment, などをおこない, mid-stage embryo reduction and については successが, early embryo については, a large amount of yolk タンパクの presence によるバックグランドの高さなどのためさらに検question を重ねている.