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染色体顕微切断-PCRによるウシY染色体DNAライブラリーの作成と性制御

染色体显微切割 - 通过 PCR 建立牛 Y 染色体 DNA 文库和性别控制

基本信息

批准号：
04806041
负责人：
岩崎説雄
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至 1993
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04806041/
关键词：
Y染色体顕微切断 PCR DNAライブラリー性判別胚

项目摘要

PCR法によるウシ胚の性判別を行つための新しいY染色体特異的DNAプローブを作成する目的で、顕微切断-PCR法を組み合わせて、ウシY染色体DNAライブラリーの作成を試みた。まず、去勢雄牛の白血球を、70時間培養後ビンブラスチンにより分裂中期停止処理を行い、染色体標本を作製した。次に倒立顕微鏡下で、マイクロマニピュレーターに装置したガラス針を用いて、Y染色体を切断・回収し、オイルチャンバー内で、DNAの抽出および制限酵素による切断を行った。これに合成リンカーおよびプライマーを結合させ、PCRによりDNAを増幅した。PCR産物をベクターに入れ、コンピーテント細胞に形質転換してDNAライブラリーを作成した。顕微切断したY染色体由来DNA断片の増幅が可能であり、これまでクローニングにより65個のインサートが得られた。このうちコロニーハイブリダイゼーションにより1個、またドットハイブリダイゼーションにより2個、計3個の雄特異的DNA断片が得られた。これらを、さらにサザンハイブリダイゼーションにより、特異性を検討した結果、雄特異的DNAクローン1個(BDYD62)が得られ、塩基配列の決定を行った。PCR法によるウシ胚の性判別の手法を確立し、体外受精由来ウシ胚盤胞の栄養外胚葉細胞の一部を切断し、これを用いてPCRにより性判別を行った。その結果、雌雄肝臓DNA断片を用いてPCRを行い、雄のみに雄特異的DNA断片(157bp)の増幅が認められた。これをウシ胚に応用した結果、胚抽出液でも同様に雄特異的DNA断片が同位置に検出され、胚においてもPCRにより性判別が可能であることが示された。今後、本研究で得られてDNAプローブを用いたPCRにより、胚及び精子の性判別の可能性が示された。

PCR method for the identification of embryo sex, and new Y-chromosome specific DNA fragments to create the purpose, micro-cut-PCR method for the assembly, and Y-chromosome DNA fragments to create the trial The white blood cells of castrated male cattle were cultured for 70 days, and the metaphase arrest process was carried out. Under the inverted microscope, the Y chromosome is cut and recovered, the DNA is extracted and the enzyme is restricted. This is the first time I've seen a woman PCR products were prepared by DNA sequencing. A microdissection of the Y chromosome resulted in an increase in the size of the DNA fragment. One, two, and three unique DNA fragments were obtained. A male specific DNA fragment (BDYD62) was identified and the nucleotide sequence was determined. PCR was used to determine the sex of embryos. In vitro fertilization was used to determine the sex of embryos. The results showed that male and female liver DNA fragments were amplified by PCR, and male and female specific DNA fragments (157bp) were amplified. The results of embryo extraction were similar to those of male-specific DNA fragments detected at the same position, and the results of embryo PCR were similar to those of male-specific DNA fragments detected at the same position. In the future, this study demonstrated the possibility of using PCR to discriminate between embryos and sperm.