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藍藻の光波長識別機能を応用した組換え藍藻における外来遺伝子発現調節システムの開発

利用蓝绿藻的光波长辨别功能开发重组蓝绿藻外源基因表达调控系统

基本信息

批准号：
05650790
负责人：
早出広司
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05650790/
关键词：
phycocyanin promoter chloramphenicol acetyltransferase photo regulation marine cyanobacteria

项目摘要

本研究は組換え藍藻の外来遺伝子発現を光によって調節するシステムを開発することを目的に行った。すなわち、(1)補色適応能力を有する藍藻Fremyella diplosiphonを用いた系ならびに(2)光波長によってフィコシアニン発現量が転写レベルで調節されている海洋藍藻Synechococcus sp.を用いた系についてそれぞれ検討した。まず、F.diplosiphonの系に関しては、当該藍藻より、光波長によって調節されているオペロンであるフィコエリスリン遺伝子をPCR法により増幅し、これを大腸菌内にクローニングした。さらにこれをF.diplosiphonに導入することを目的に同領域を広宿主域ベクタpKT230にクローニングした。しかし、これまでのところ、このプラスミドの複製がF.diplosiphonにおいてみられず、発現系の検討には至っていない。一方、海洋藍藻Synechococcus sp.を用いた系では、まず、淡水藍藻Anacystis nidulansよりフィコシアニンプロモータの領域をPCRで増幅、これをモデル外来遺伝子であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)の上流につなぎ、広宿主域ベクタpKT230にクローニングした。その結果、同プラスミドは海洋藍藻ないで安定に複製され、また、CAT遺伝子の発現が見られた。培養開始後、約100時間の対数増殖期後期において、CATの発現量は最大となった。その時の発現量はこれまでに報告してきたカナマイシシン耐性遺伝子のプロモータを用いてCATを発現させた場合の20倍以上の値を達成し、本プロモータが海洋藍藻における外来遺伝子発現においてきわめて有効であることが明らかとなった。さらに、本プロモータの光波長による発現調節を試みた。すなわち、今回構築した組換え藍藻の赤色および緑色光下で培養した。赤色光下では、前培養時に発現していたCATが速やかに減少し、100時間後には細胞内でのCATの発現はみられなかった。一方、これに対して、緑色光下では前培養時の活性が徐々に増加し、発現後のCATの減少はみられず、細胞あたりの発現量は最高で白色光下の2倍程度まで増加した。このように、外来遺伝子の発現を海洋藍藻内で光波長によって制御することに成功し、今後の組換え藍藻を用いた有用物質生産系への貴重な基礎的知見を得ることができた。さらに、今回見られた制御系に関して分子レベルで検討することが必要である。

The aim of this study is to regulate the development of alien genes in cyanobacteria. (1) Complementary color adaptation ability of marine cyanobacteria Fremyella diplosiphon (2) Wavelength of light emission of marine cyanobacteria Synechococcus sp.(3) Complementary color adaptation ability of marine cyanobacteria Fremyella diplosiphon (2) Wavelength of light emission of marine cyanobacteria Synechococcus sp. The relationship between F.diplosiphon and E. coli was analyzed by PCR. For example, if you want to import a product from a domain, you can import it from a domain. The first step is to create a system that is capable of generating and reproducing information. One side, marine cyanobacteria Synechococcus sp., use the middle system, the other side, freshwater cyanobacteria Anacystis nidulans As a result, the presence of CAT genes in marine cyanobacteria has been observed. At the beginning of culture, about 100 days after the beginning of growth period, CAT production reached its maximum. The amount of time required for the discovery of alien genes was reported to be 20 times higher than that of CAT in the case of discovery. The discovery of alien genes in marine cyanobacteria was reported to be 20 times higher than that of CAT in the case of discovery. In this case, the wavelength of the light source is adjusted. Culture of cyanobacteria in red and green light CAT was found in the cells before and after 100 hours of incubation. On the other hand, under green light, the activity of CAT increased gradually before culture, and the activity of CAT decreased after culture. The activity of CAT increased twice as much as that under white light. The discovery of these exotic molecules in marine cyanobacteria has led to the successful control of light wavelengths and the discovery of valuable basic knowledge for the production of useful substances in future cyanobacteria. Now, it's time to discuss how to control the system.