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酵素酸化・還元中心の蛍光モニタリングによるオプトロ-ドバイオセンサの開発

通过荧光监测酶氧化/还原中心开发光极生物传感器

基本信息

批准号：
03805094
负责人：
早出広司
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は酵素の酸化還元反応中心の蛍光を直接モニタリングする原理に基づく、酵素反応の直接検出を応用したバイオセンサ-構築を目的としている。本研究では、ピロロキノリンキノン(PQQ)を補酵素に有するキノプロテイングルコ-スデヒドロゲナ-ゼ(PQQGDH)を用いた。これまでに種々のPQQGDHが報告されているがいずれも精製が容易とはいえず、また用いる緩衝液のイオン強度の影響を受け失活しやすいという欠点があった。そこで本研究では、高い塩濃度でも活性が維持でき、また精製が容易なPQQGDHを海洋細菌からスクリ-ニングを行った。その結果、西伊豆沿岸の海水試料から単離された海洋細菌、Pseudomonas sp.N11からPQQを補酵素とするGEHがスクリ-ニングされた。本海洋細菌は増殖に高塩濃度を要求する典型的な海洋細菌であった。このPQQGDHはグルコ-スに対して高い選択性を示した。また等電位が低いことから陰イオン交換クロマトグラフィによって容易に精製できた。さらに、これまでに報告されているPQQGDHは塩濃度1%程度で10%以下に活性が失活してしまうのに対し、本酵素同塩濃度で90%以上の活性を維持し、また3%以上の高塩濃度でも40%以上の活性を保持できるきわめて耐塩性の高い酵素であった。なお海洋からPQQGDHが単離されたのは本研究がはじめてである。この酵素を用いて、反応中心のPQQの蛍光のモニタリングを試みた。PQQは還元されPQQH_2となるが、そのときPQQに特徴的な480nm付近の蛍光が減少する。しかし、PQQが酵素本体と結合している状態での蛍光に関する情報は全く知られていない。遊離状態のPQQは励起波長360nmにより、480nm付近に蛍光を発するが、本研究の結果、PQQが酵素と結合状態にある場合には、同じ励起波長で、460nm付近と単波長側へ蛍光がシフトすることが明らかとなった。そこでホロ型のPQQGDHを用いて、グルコ-スを添加したときの蛍光の変化を測定した。その結果、グルコ-ス添加により、明かにPQQに由来する蛍光が減少することが確認された。このことから蛍光法により、酵素反応の反応中心の直接モニタリングが行えることが示された。しかし、その反応はきわめて速いことから、常温では蛍光変化の経時変化を追尾することは不可能である。また。このシステムを構築するためには高度に精製された酵素が大量に必要であることもわかった。そこで、このシステムを完成するために、さらに(1)酵素反応を遅延するために氷点下での同酵素反応の検討、(2)クロ-ニングによるPQQGDHの大量生産に関する研究を進めている。

This study aims to establish the basic mechanism for the direct activation of the enzyme's catalytic activity center and the basic mechanism for the direct activation of the enzyme's catalytic activity center In this study, the use of PQQ (PQQ) as a supplement to vitamin C (PQQGDH) was investigated. The PQQGDH is reported to be easy to refine and to be inactivated by buffer strength. In this study, the activity of PQQGDH was maintained at high concentrations, and it was easy to refine PQQGDH. The results showed that the seawater samples along the coast of Nishii were isolated from marine bacteria, Pseudomonas sp.N11, PQQ and GEH. This marine bacteria requires high concentrations of bacteria to grow. The PQQGDH has a high selectivity. It's easy to refine the electric field. PQQGDH activity is inactivated at concentrations of 1% or less and maintained at concentrations of 90% or more, and activity is maintained at concentrations of 3% or more and maintained at concentrations of 40% or more. PQQGDH This enzyme uses chemical, anti-inflammatory center PQQ light and anti-inflammatory agent. PQQ is characterized by a decrease in the wavelength of 480nm. PQQ is the enzyme that binds to the state of light and information about the state of light is fully known. The results of this study show that PQQ in free state emits light at excitation wavelengths of 360nm and 480nm, respectively, and that PQQ in bound state emits light at excitation wavelengths of 460nm and 480 nm, respectively. PQQGDH is used to measure the change of light. The result of this is that the light source of the PQQ is reduced. This event demonstrates that the direct monitoring of the enzyme reaction center can be carried out by the light method. It's impossible to change the temperature of light.また。The structure of the system is highly refined and the enzyme is essential. (1) Study on isoenzyme reaction under enzyme reaction conditions;(2) Study on mass production of PQQGDH under enzyme reaction conditions.