ルミノール化学発光の遅延現象を利用する還元性生理活性物質の高感度分析法

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1.生理活性物質として重要な役割を果たしているグルタチオン(GSH)は銅(II)触媒を用いる接触酸化により,H_2O_2と二硫化物を生成する。いま,生成するH_2O_2をペルオキシダーゼ(POD)を触媒とするルミノール化学発光(CL)で反応開始から逐次測定したとき,CLが遅延して発現する現象を見出した。そこで本研究では,本遅延CL反応をGSHの計測法に応用した。なお,PODには西洋わさび由来のHRPおよび微生物由来のARPを使用した。HRPおよびARPを用いて,銅(II)触媒によるGSHの接触酸化で生成するH_2O_2を測定した結果,いずれのPODにおいても,反応開始直後に第一ピークが,さらに,反応開始後しばらくしてから第2ピークが発現した。第2ピークが発現する時間はARPのほうが短かった。また,いずれのPODにおいても,第2ピーク強度がGSH濃度に依存したことから,第2ピーク強度が最大になるように,pH,POD,ルミノールおよび銅(II)濃度を最適化し,検量線を作成した。ARPを用いた場合,GSH濃度が7.5x10^<-7>M〜3.0x10^<-5>Mの範囲で,また,HRPを用いた場合,1.0x10^<-5>M〜1.0x10^<-3>Mの範囲でCL強度と良好な直線関係が得られた。以上の結果から,ARPを用いた場合,従来法と比較してより高感度なGSHの定量が可能である。2.HRPとARPを用いた場合とで,第2ピークが発現する時間が変化した原因を明らかにするため,それぞれのPODサイクルで生成するPOD中間体の生成速度をストップドフロー法で求めた。その結果,POD中間体の生成速度はHRP系に比較してARP系において著しく増大することがわかった。したがって,ARPの場合,ルミノールラジカルの生成速度も速いことが予想され,そのためHRPに比較して第2ピークの応答が早まったものと考えられる。