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ルミノール化学発光によるチトクロームP-450の高感度分析法の開発

使用鲁米诺化学发光法开发细胞色素 P-450 的高灵敏度分析方法

基本信息

批准号：
07650970
负责人：
上舘民夫
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07650970/
关键词：
化学発光チトクロムP-450 ルミノール

项目摘要

生体膜に存在するチトクロムP-450は、分子状酸素を活性化して医薬品や化学物質などの低分子有機基質の代謝反応の関与し、重要な生理機能を有している。したがって、これまでに多くの分析法が開発されてきたが、十分な感度が得られていないのが現状である。そこで、本研究においてルミノール化学発光(CL)を利用するP-450の高感度分析法の開発を試みた。本測定原理によりP-450の高感度分析法を確立するためには、P-450を触媒とするルミノールCL反応について、発光効率に影響する因子について検討する必要がある。はじめに、CL強度に及ぼすTriton X-100の影響について検討した。Triton X-100がミセルを生成しない濃度条件におけるCL強度と、ミセルを生成する濃度条件におけるCL強度を比較すると、Triton X-100の臨界ミセル濃度付近でCL強度が著しく増大することが明かとなった。つぎに、CL強度に及ぼすグリセロール濃度の影響を検討した。その結果、グリセロール濃度が20%付近まではCL強度に大きな変化はなかったが、20%以上になるとCL強度は徐々に減少した。つぎにCL強度に及ぼすpHの影響について検討した。その結果、pHの値が増大するにしたがってCL強度は増大した。最後に、ルミノールおよび過酸化水素濃度の影響について検討した。その結果、CL強度はそれぞれの濃度に依存し、ルミノール濃度が1.0x10^<-3>Mまた過酸化水素濃度が5.0x10^<-2>Mのとき、CL強度は最大になった。以上の最適条件で、P-450の検量線を作成した。その結果、検出下限である2.0x10^<-10>Mから1.0x10^<-7>Mの濃度範囲において、CL強度とP-450濃度との間に良好な直線関係が得られた。本法によるP-450の検出感度は従来用いられている吸光光度法の検出感度と比較して約2,500倍感度が増大した。以上の結果から、吸光光度法では定量できなかった超微量のP-450の定量が可能になった。

P-450 plays an important physiological role in the activation of molecular acids, metabolism of low molecular weight organic substrates and chemical substances in biological membranes. The analysis method is developed, and the sensitivity is obtained. In this study, the development of high sensitivity analytical method using P-450 was studied. The principle of this determination is to establish a high sensitivity analysis method for P-450. It is necessary to investigate the factors affecting the reaction and luminescence efficiency of P-450. The influence of CL intensity and Triton X-100 on the performance of the system is discussed. The CL intensity of Triton X-100 is higher than the CL intensity of Triton X-100 when the concentration of Triton X-100 is close to the critical concentration. The influence of the concentration of CL, CL and CL was investigated. The results show that the CL intensity decreases gradually when the concentration of CL is close to 20%. The influence of CL intensity and pH on the quality of the product is discussed. As a result, the pH value increased and the CL intensity increased. Finally, the effect of excessive acidification on water concentration is discussed. The results show that CL intensity is concentration-dependent, and CL intensity is maximum when CL concentration is 1.0x10^<-3>M or 5.0x10^<-2>M. The optimum conditions are described above, and the P-450 calibration curve is constructed. A <-10><-7>good linear relationship between CL intensity and P-450 concentration was obtained. The detection sensitivity of P-450 in this method is about 2,500 times higher than that in the absorption method. The above results show that absorbance can be used for quantitative determination of P-450 in ultra-small amounts.