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D-乳酸脱水素酵素の構造と機能に関する研究

D-乳酸脱氢酶的结构与功能研究

基本信息

批准号：
05660082
负责人：
田口速男
金额：
$ 1.15万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05660082/
关键词：
D-乳酸脱水素酵素活性中心乳酸菌 Lactobacillus plantarum

项目摘要

おもにアミノ酸残基置換による解析から、Lactobacillus plantarum D-乳酸脱水素酵素(D-LDH)においては、His-296が酸塩基触媒として作用し、Arg-235が基質の結合に重要であることが示された。すなわちこれらの残基は、L-LDHのHis-195とArg-171にそれぞれ対応し、両LDHは、進化的には大きく隔たる酵素でありながら、きわめて類似した基質結合と触媒の機構を備えていることを示している。さらにL-LDHにおいてはHis-195と対をなすAsp-168の負電荷が、基質ピルビン酸との結合及び触媒上の遷位状態の構造を安定化していると考えられているが、そこでこれに対応する残基をD-LDHにおいて検索した。D-型酵素ファミリーにおいて保存されている、193、200、240位のAsp、264位のGlu残基のカルボキシル基を、それぞれ部位指定変異によりアミド基に置換したところ、Glu-264をGlnに置換した場合にのみ大きな活性低下が見られた。既にL.bulgaricus D-LDHにおいて、Glu-264をGlyに置換した変異型酵素が報告されている。この場合には酵素活性は大きく低下せずに、そのpH依存性が大きく酸性側にシフトしたことから、Glu-264は触媒活性に必須ではなく、触媒His残基の近傍に位置することにより、酵素のpH依存性を中性付近に調節している残基と考えられている。しかしながら、L.plantarum D-LDHにおいてGlu-264を同様に負電荷を消失させるGlnに置換した場合には、顕著なpH依存性のシフトは認められず、並異型酵素は、大幅に増大したKm値と減少したkcat値を示した。この結果はL-LDHにおいてAsp-168をAsnに置換した結果によく対応し、本残基がL-LDHにおけるAsp-168のそれと相同な機能を持つことを強く示唆している。本結果はL.bulgaricus酵素の結果と異なるが、もし両D-LDHにおいてGlu-264の機能に相違が無ければ、L.bulgaricus酵素の場合は、残基を側鎖の無いGlyに置換したために、酵素の構造にさらに大きな変化が引き起こされた結果とも考えられる。

From the analysis of the lack of acid residue replacement, the role of Lactobacillus plantarum D-lactate dehydrin enzyme (D-LDH), the role of His-296 as an acid-based catalyst, and the importance of Arg-235 in matrix binding are demonstrated. L-LDH and His-195 and Arg-171 are the most important residues in the evolution of LDH. In addition, the negative charge of His-195 and Asp-168, the combination of matrix and acid, and the structure of transition state on the catalyst were stabilized. D-type enzyme: Asp at position 193, Asp at position 200, Asp at position 240, Asp at position 264, Asp at position 2 L.bulgaricus D-LDH, Glu-264, Gly and isoenzymes were reported. In this case, the enzyme activity is greatly reduced, the pH dependence of the enzyme is greatly reduced, the Glu-264 catalytic activity is required, and the catalytic residue is located in the vicinity of the enzyme. However, when Gln is replaced by L.plantarum D-LDH, the negative charge disappears due to the addition of Glu-264. However, the pH dependence of the enzyme is not recognized, and the isoenzyme has a significant increase in Km value and a decrease in kcat value. The result was that Asp-168 was substituted for L-LDH, and Asp-168 had the same function as L-LDH. The results of this study were different from those of L.bulgaricus enzyme, which showed that the function of Glu-264 was not consistent with that of L.bulgaricus enzyme, and that the residue was locked and replaced by Gly. The structure of L.bulgaricus enzyme was changed.