乳酸菌乳酸脱水素酵素における酵素機能の変換

乳酸菌乳酸脱氢酶的酶功能转换

• 批准号: 06660094
• 负责人: 田口 速男
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06660094/
• 关键词: 乳酸菌; D-乳酸脱水素酵素; 基質特異性; L-乳酸脱水素酵素; アロステリック酵素

D-LDH野Glu-264残基は、D-2-ヒドロキシ酸脱水素酵素ファミリーにおいて高度に保存されているが、基質特異性が異なるにも関わらず構造的には同酵素ファミリーの一員である蟻酸脱水素酵素(FDH)においては、例外的にこれがGlnに置換されている。L.plantarumD-LDHにおいて、この残基をGln及びAspに置換したところ、特にGlnへの置換によりD-LDH活性は著しく低下したが、FDH活性が生じるまでにはいたらなかった。一方2-位にケト基をもつオキザム酸とこれをもたない蟻酸あるいはプロピオン酸は、ともに基質ピルビン酸と競合して本D-LDHを阻害したが、野生型酵素においては、前者による阻害が後者のそれよりはるかに強く、かつより顕著なpH依存性を示した。これに対しGln型変異酵素では、蟻酸及びプロピオン酸による阻害はやや増大していたが、逆にオキザム酸による阻害はこれらと同等ないしは下まわるまで大きく減少し、かつその顕著なpH依存性も失われていた。またAspに置換した場合においては、オキザム酸の阻害効果及びpH依存性は減少したものの、依然として野生型の傾向を示した。以上の結果から、D-2-ヒドロキシ酸脱水素酵素においては、Glu-264の負電荷が、プロトン化した触媒中心His-296とリガンド上の2-ケト基との相互作用を助長し、これによって触媒作用を促進すると共に、D-LDHの2-ケト酸に対する結合の特異性も高めていることが明らかとなった。一方2-ケト酸を基質としないFDHでは、この負電荷は不用であるため欠失していると考えられる。しかしFDHとしての機能をもつためには、この置換の他にさらにそのための触媒機構の付与が必要であることも示され、現在本D-LDHのFDHへの機能変換をとうしてこれを検討中である。乳酸菌のアロステリック及び非アロステリックL-LDHに関しては、酵素の大量生産系を利用して現在良好な結晶が得られつつあり、結晶解析を行いつつある。

D-LDH Glu-264 residues are highly conserved, substrate-specific, and related to the structure of formate dehydratase (FDH), a member of the isoenzyme, and are replaced by D-2-deoxy-D-2-deoxy-D-deoxy-D-deoxy-D- L. plantarum D-LDH activity is low due to substitution of Gln and Asp residues, and FDH activity is low due to substitution of Gln and Asp residues. On the one hand, the 2-bit base acid and the formic acid compete with each other to inhibit the D-LDH, and the wild-type enzyme does not. The former inhibits the D-LDH more than the latter. However, the pH dependence is also shown. For Gln-type isoenzymes, the inhibition of formic acid, formic acid and citric acid increases, and the inhibition of citric acid decreases, and the inhibition of citric acid decreases. Asp substitution shows the tendency to decrease the resistance to acid and pH dependence. The results showed that the interaction of D-2-LDH with Glu-264 was promoted by the negative charge of Glu-264, the catalytic center of Glu-264, the catalytic activity of Glu-264, and the specificity of D-LDH binding with 2-LDH. A square 2-acid matrix is not used for negative charge. The function of FDH and LDH should be changed. The function of FDH and LDH should be changed. Lactic acid bacteria and non-lactic acid bacteria related to the use of enzyme mass production system, now good crystallization, crystallization analysis

项目成果

田口速男,太田隆久: "Role of histidine 188 in fructose 1,6-bisphosphate-and divalent cation-regulated L-lactate dehydrogenase of Lactobacillas casei" Biosci,Biotech,Biochem.59. 451-458 (1995)

Hayao Taguchi、Takahisa Ota：“干酪乳杆菌果糖 1,6-二磷酸和二价阳离子调节的 L-乳酸脱氢酶中组氨酸 188 的作用”Biosci,Biotech,Biochem.59 (1995)。

田口速男 太田隆久: "Essential role of arginine235 in the substrate-binding of Lactobacillus plantarum D-lactate dehydrogenase" Journal of Biochemistry. 115. 930-935 (1994)

Hayao Taguchi 和 Takahisa Ota：“精氨酸 235 在植物乳杆菌 D-乳酸脱氢酶底物结合中的重要作用”《生物化学杂志》115. 930-935 (1994)。