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乳酸脱水素酵素にみられる酵素学的多様性とその機能構造の蛋白質工学的解析

乳酸脱氢酶酶多样性和功能结构的蛋白质工程分析

基本信息

批准号：
04660078
负责人：
田口速男
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

(D-乳酸脱水素酵素の構造と機能)Lactobacillus plantarum D-乳酸脱水素酵素において、この酵素の属する脱水素酵素ファミリー酵素間で保存性の高い二残基のHis残基を、部位指定変異により他のアミノ酸に置換した変異型酵素を作製した。そしてそれらの触媒上の性質を検討した結果、本酵素のHis296がL-乳酸脱水素酵素におけるHis195に相当する役割を持つ、事実上の触媒残基であることが明らかになった。またこの酵素ファミリーの酵素間で保存されている唯一のArg残基であるArg235を他の残基に置換し検討したところ、この残基がL-乳酸脱水素酵素におけるArg171と相同な役割をもち、この残基のグアニジノ基が、基質の結合とその活性中心での正確な配向に重要な役割を持っていることが明らかになった。以上の結果よりD-型乳酸だ水素酵素はL-型酵素と一次構造上の相同性はなく、進化的に隔たった酵素であるにも関わらず、その基質結合と触媒の機構は極めて類似したものであることが示された。(L-乳酸脱水素酵素のアロステリック特性)非アロステリック型酵素であるL.plantarumの酵素はアロステリック型であるL.casei酵素と高い一次構造上の相同性を示すが、活性化因子フルクトース二リン酸(FBP)結合に重要なHis188がAspに置換されている。そこでL.casei酵素のHis188をAspに置換した変異型酵素を作製し検討した。この変異型酵素はFBPに非感受性を示したが、マンガンに対する感受性を残していた。また野生型酵素と異なり、FBP非存在下でも微弱な活性を示したが、L.plantarum酵素のような完全な活性型ではなかった。この結果はL.plantarum酵素のHis188変異酵素の結果とあわせて、His188はFBPの結合には重要であるが、それを通じての活性制御には他の部位が関与していることを示している。現在おもに両者のキメラ酵素の作製を通じてこの部位の検討を行いつつある。

(D-The structure and function of Lactobacillus plantarum D-lactate dehydratase. The structure and function of His enzyme are different from those of the other enzymes. An examination of the properties of the catalyst revealed that His296 of this enzyme is equivalent to His195 of the L-lactate dehydrin enzyme, and it is clear that the actual catalyst residue is present. The only Arg residue in the enzyme is Arg235, which is important for the correct alignment of the active center of the enzyme. The above results show that the D-type lactate enzyme has the same structure as the L-type enzyme, and the enzyme structure is similar to that of the substrate binding enzyme. (L-The enzyme of lactic acid dehydratase has the same structure as L.casei enzyme, and the activation factor FBP binding is important for His188 and Asp substitution. The 188 Asp of L.casei enzyme was used to control alloenzymes. This allozyme is not sensitive to FBP, but sensitive to FBP. The wild-type enzyme is different, the weak activity is shown in the absence of FBP, and the L.plantarum enzyme is completely active. The results of the enzyme His188 in L.plantarum are important for the binding of His188 FBP to other sites. Now, we can control the enzyme activity by analyzing the site.