in vitro転写系を用いたHTLV-I P40による転写活性化機構の解析

利用体外转录系统分析HTLV-I P40的转录激活机制

• 批准号: 05670275
• 负责人: 仁木 賢
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05670275/
• 关键词: HTLV-I; P40^<tax>; ヘパリンアガロースカラム; in vitro転写系

HTLV-I感染細胞、HUT102ならびに非感染細胞、Jurkatより核抽出液を調整し、ヘパリンアガロースカラムを用いてKCl濃度にて分画を行い、0.1M、0.2M、0.3M、1M KClの各分画を得た。まず、HUT102の各分画について、p40^<tax>に対するモノクローナル抗体にてウエスタンブロッティングを行ったところ、p40^<tax>は、0.1M KCl分画(flow through)に大部分が溶出されるが、0.2M、0.3M、1Mの各分画にも検出された。次に、ゲルシフトアッセイを行ったところ、21塩基配列をプローブとした時には、HUT102、Jurkatとも、0.2M、0.3M、1M KCl分画にDNA結合活性が認められた。NF-κB配列をプローブとした時には、HUT102の0.1M、0.2M、0.3M、1M KClの全分画にDNA結合活性が認められたが、Jurkatの各分画にはDNA結合活性は認められなかった。さらに、これらの各分画をin vitro転写系に加えたところ、HUT102の0.2M、0.3M KCl分画は、21塩基配列、NF-κB配列をそれぞれエンハンサーとして持つ鋳型DNAの転写を活性化したが、Jurkatの0.2M、0.3M KCl分画には、転写活性化能は、認められなかった。また、HUT102、Jurkat双方の1M KCl分画は、どちらのエンハンサーの転写も抑制することより、1M KCl分画には、細胞非特異的な転写抑制因子が含まれると考えられた。最後に、p40^<tax>の機能をあきらかにするために、転写活性化能の認められたHUT102の0.2M、0.3M KCl分画にさらに二種類の抗p40^<tax>モノクローナル抗体を加えたところ、どちらの抗体も、21塩基配列、NF-κB配列をエンハンサーとする鋳型DNAからの転写を、最大50%抑制した。このことより、p40^<tax>は、転写そのものに作用するのみならず、細胞因子の修飾にも関わっている可能性も考えられた。

HTLV - infected cells, I HUT102 な ら び に non infected cells, Jurkat よ り nuclear extract を adjusting し, ヘ パ リ ン ア ガ ロ ー ス カ ラ ム を with い て KCl concentration に て painting line を い, 0.1 M, 0.2 M, 0.3 M, 1 M KCl の each painting を た. ま ず, HUT102 の each painting に つ い て, p40 ^ < tax > に す seaborne る モ ノ ク ロ ー ナ ル antibody に て ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ を line っ た と こ ろ, p40 ^ < tax > は, 0.1 M KCl (flow through)に most of the が dissolves されるが, 0.2M, 0.3M, 1M <s:1> each subplot に 検 検 された. に, ゲ ル シ フ ト ア ッ セ イ を line っ た と こ ろ, 21 salt base with column を プ ロ ー ブ と し た when に は, HUT102, Jurkat と も, 0.2 M, 0.3 M, 1 M KCl に DNA binding activity が recognize め ら れ た. Nf-kappa B match column を プ ロ ー ブ と し た when に は, HUT102 の 0.1 M, 0.2 M, 0.3 M, 1 M KCl の all points draw に DNA binding activity が recognize め ら れ た が, Jurkat の each painting に は DNA binding activity は recognize め ら れ な か っ た. さ ら に, こ れ ら の each painting を in vitro planning write department に plus え た と こ ろ, HUT102 の 0.2 M, 0.3 M KCl は, 21 salt base with columns, the nf-kappa B column を そ れ ぞ れ エ ン ハ ン サ ー と し て hold つ type where DNA の planning write を activeness し た が, Jurkat の 0.2 M and 0.3 M KCl is divided into に に, 転 to write the active chemical energy 転, and められな った った. ま た, HUT102, Jurkat の both 1 m KCl painting は, ど ち ら の エ ン ハ ン サ ー の planning write も inhibit す る こ と よ り, 1 m KCl に は, cells of nonspecific な planning write inhibitory factor が containing ま れ る と exam え ら れ た. Final に, p40 ^ < tax > の function を あ き ら か に す る た め に, planning can write activeness の recognize め ら れ た HUT102 の 0.2 M and 0.3 M KCl points draw に さ ら に two kinds の resistance p40 ^ < tax > モ ノ ク ロ ー ナ ル antibody を plus え た と こ ろ, ど ち ら も の antibody, 21 salt base with columns, the nf-kappa B column を エ ン ハ ン サ ー と す る type where DNA か ら の planning write を, maximum 50% inhibition し た. こ の こ と よ り, p40 ^ < tax > は, planning to write そ の も の に role す る の み な ら ず, cytokines の modified に も masato わ っ て い る possibility も exam え ら れ た.