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遺伝子工学と光ピンセットを用いたキネシンの運動再構成系

使用基因工程和光镊的驱动蛋白运动重建系统

基本信息

批准号：
05680572
负责人：
豊島陽子
金额：
$ 1.15万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05680572/
关键词：
キネシン微小管モーター蛋白質

项目摘要

細胞運動を担うモーター蛋白質(ミオシン、ダイニン、キネシン等)の分子メカニズムの研究には、再構成系での運動観察が重要な手法となっているが、従来の再構成運動系では、モーター分子は非特異的に基板に吸着され、特定の部位で固定することはできなかった。そのため、運動活性がモーター分子の持つ能力によるものか、吸着の仕方が適当であるか否かによるものかを区別することができなかった。そこで、本研究では遺伝子組換え技術を用いてモーター分子に反応性の高い特異残基を導入し、モーター分子の特定の部位を基板に付着させる方法の開発を試みた。キネシンは反応性の高いSH基を持たないので、大腸菌で大量発現されているショウジョウバエのキネシン遺伝子を用い、モータードメイン(頭部)にシステインとしてSH基を導入した。導入するシステインのSH基の反応性を高めるために、リジン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸をシステインの隣に配した塩基配列を、PCR法を用いてキネシン頭部のC末端の遺伝子に挿入した。作製したクローンは大腸菌での発現率が良く、GSTのフュージョン蛋白質として大腸菌蛋白質の50%近くを占めた。単離されたキネシン頭部の蛋白質は、ATPase活性を持ち、微小管結合能力を持つものであった。導入したシステイン残基はビオチン-マレイミドとの反応性が非常に高く、特異的に修飾された。このようにビオチン化されたキネシン頭部はアビジンに結合し、更にアビジンを介してガラス上のビオチン化BSAに結合し、再構成運動系で微小管を動かすことができた。運動の速さは、0.8μm/sec前後であり、intactなfull lengthのキネシンと同様であった。この新たな系により、キネシン頭部のみでも微小管を動かすのに十分であることを明らかにすることができた。モーター分子の特定の部位を固定することは、ミオシン頭部でも成功しており、汎用性の高いものであり、今後、運動発生機構の核心に迫る研究の展開が期待できる。

It is important to study the molecular structure of cell motility proteins (Microkin, ダイニン, キネシン, etc.), and to reconstruct the kinetics of the system.法となっているが, 従来の Reconstructed Kinetic System では, モーターmolecule は无特Different substrates can be adsorbed and specific parts can be fixed.そのため、kinetic activity がモーターmolecule のholding ability によるものか、sucking のShifang がであるか不かによるものかをdifferentiation することができなかった. The main purpose of this research is to use sub-combination technology to use high-reactivity and specific residues of molecules. The method of introducing the base into a specific part of the molecule and attaching it to the substrate is a test method.キネシンは refractory high いSH base をhold たないので, coliform で a large number of 発appear されているショウジョウバエのキネシン伝子を用い、モータードメイン(head) にシステインとしてSH kiを Import した. Import するシステインのSH-based reactive を高めるために、リジン、アルギニンなどの塩 Basic アミノ acid をThe システインの orthoにmatching した塩base arrangementを, the PCR method uses the いてキネシン head and the C-terminal の缝子にinsertionした. The production rate of coliform bacteria is good, and the GST protein and coliform protein ratio is close to 50%. The protein in the head of the isolated protein, the ATPase activity, and the microtubule binding ability are maintained. Imported したシステイン residue はビオチン-マレイミドとのreactivity is very high and specific に modified された.このようにビオチン化されたキネシン头はアビジンにcombinationし、にアビジンを IntroductionしてThe ガラス上のビオチン化 BSAに combines and reconstructs the kinematic microtubule motion かすことができた. Movement speed, 0.8μm/sec back and forth, and full length contact. The new たな system により, the キネシン head のみでもmicro tube movableかすのに十であることを明らかにすることができた. The specific part of the モーターmolecule is fixed, the head of the ミオシン head is successful, and the pan The high usability is the key to the future, and the research and development at the core of the sports development organization are expected.