TGF-βスーパーファミリーの象牙質発生過程における発現

TGF-βスーパーファミリーに属する未知の遺伝子をクローニングするべく、BMP-2&4,GDF-1の活性部位(ホモログ部)のDNA塩基配列により、DNAシンセサイザーを用いて3'末端プライマーおよび5'末端プライマー各々2種を作製した。3〜4週令ラット上下顎切歯から初期石灰化期に到るまでの根尖部歯髄を摘出し、AGPC法にて total RNA を分離した。ポリA^+RNAをオリゴdTセルロースにて精製し、Stratageneの Uni-Zap XR キットを用いてλZAPIIベクターに組み込んだcDNAライブラリーを作製した。このライブラリーをテンプレートとして前記各々2種のプライマーを用いて94℃15秒、44℃30秒、72℃1分30サイクルのPCRを行い、さらにそのPCR産物を用いて94℃15秒、54℃30秒、72℃1分30サイクルのPCRを行った。アガロースゲルからMagic PCR PrepにてcDNAを精製し、InvitorogenのTAクローニングシステムを用いて遺伝子をクローニングした。シーケンサーにて遺伝子塩基配列を決定した。得られた塩基配列をDNASIS-Macを用いて検索したところ、2つは既知のBMP-2およびBMP-4の塩基配列と完全に一致した。もうひとつはGDF1およびGDF7と54%のホモロジーが認められたが、TGF-βスーパーファミリーに特異的な活性部位の7つのシステインのうち4つがグルタミン酸に置換されており、ファミリーの一種とは考えにくいと思われた。現在、ホモログ部を除く部分のBMP-4のcDNAよりRNAプローブを作製し、ラット臼歯部生活歯髄切断後の歯髄創傷治癒過程におけるBMP-4のmRNAの発現をin situ hybridization 法により検討中である。

TGF-βスーパーファミリーに属する未知の遺伝子をクローニングするべく、BMP-2&4,GDF-1の活性部位(ホモログ部)のDNA塩基配列により、DNAシンセサイザーを用いて3'末端プライマーおよび5'末端プライマー各々2種を作製した。3〜4週令ラット上下顎切歯から初期石灰化期に到るまでの根尖部歯髄を摘出し、AGPC法にて total RNA を分離した。ポリA^+RNAをオリゴdTセルロースにて精製し、Stratageneの Uni-Zap XR キットを用いてλZAPIIベクターに組み込んだcDNAライブラリーを作製した。このライブラリーをテンプレートとして前記各々2種のプライマーを用いて94℃15秒、44℃30秒、72℃1分30サイクルのPCRを行い、さらにそのPCR産物を用いて94℃15秒、54℃30秒、72℃1分30サイクルのPCRを行った。アガロースゲルからMagic PCR PrepにてcDNAを精製し、InvitorogenのTAクローニングシステムを用いて遺伝子をクローニングした。シーケンサーにて遺伝子塩基配列を決定した。得られた塩基配列をDNASIS-Macを用いて検索したところ、2つは既知のBMP-2およびBMP-4の塩基配列と完全に一致した。もうひとつはGDF1およびGDF7と54%のホモロジーが認められたが、TGF-βスーパーファミリーに特異的な活性部位の7つのシステインのうち4つがグルタミン酸に置換されており、ファミリーの一種とは考えにくいと思われた。現在、ホモログ部を除く部分のBMP-4のcDNAよりRNAプローブを作製し、ラット臼歯部生活歯髄切断後の歯髄創傷治癒過程におけるBMP-4のmRNAの発現をin situ hybridization 法により検討中である。