イオン輸送蛋白質の系統的分析による腎疾患病態解析

通过离子转运蛋白的系统分析对肾脏疾病进行病理学分析

• 批准号: 07670176
• 负责人: 大久保 研之
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07670176/
• 关键词: バンド3蛋白質; H^+-ATPase; 水チャネル; 腎尿細管上皮細胞; 尿沈渣; 遺伝子解析

1)尿沈渣細胞の分離: 腎疾患患者(尿細管性アシドーシス、糸球体腎炎、ネフローゼなど)の尿20mlを、1500rpm,5分間遠心し、得られた沈渣に対して5mlの氷冷リン酸バッファーを加えて良く洗浄し、Percollによる濃度勾配遠心法でおおまかに大型の扁平上皮と、小型円形の尿細管上皮細胞の分画に分けた。これらのうち前者からはゲノムDNAを、後者からはRNAを分離した(検体採取が迅速に行われた場合にはRNAの回収が可能であった。)2)バンド3蛋白質のPCRとシークエンシング:腎臓には主に二種類のバンド3蛋白質(AE1, AE2)が発現していることが知られており、その発現には細胞特異性、極性がそれぞれに認められる。発現している蛋白質の遺伝子解析をPCRによって行う目的で、プライマーをエクソン部分に設計した。いずれもcDNAがクローニングされているが、ゲノム構造も解析されているのはAE1のみであり、その配列類似性によってAE2についてもエクソン部分を推測した。RNAをテンプレートとしたRT-PCRでは、各エクソンのみでなく、全エクソンを含む全長それぞれAE1 3.1kb, AE2 4.2kbのPCR産物を得ることにも成功した。ゲノムDNAをテンプレートとしたものでは、全ゲノムAE1 13kb, AE2 18kbを3〜5つの部分に分け、増幅することができた。現在AE2のゲノミ配列についてはシークエンシング進行中であるが、PCRの際いくつかのプライマーでは条件を変えても増幅できないことからエクソン-イントロンのジャクション部位と推測していた領域は、そうであることを確認した。患者由来のテンプレートによるPCRとその産物の解析も、同時進行しているが、現在までのところ異常を発現できた症例はいない(私信によると、イギリスのグループが尿細管性アシドーシスの一家系において、病態と連鎖していると思われるAE1の変異を検出し得たとのことである)。3)H^+-ATPaseと水チャネルの遺伝子解析:尿の酸性化とその量については、陰イオン交換体以外にもH^+-ATPaseと水チャネルが関わっているため、これらについても2)と同様にして遺伝子解析を進めている。4)尿細管上皮細胞のウェスタンブロッティング:尿沈渣より回収した尿細管上皮細胞はそのままSDS-PAGEサンプルバッファーに溶解し、全細胞蛋白質を用いた電気泳動一免疫染色(AE1のC末端領域に対する抗体、抗8.5K抗体で検出)を行った。約100kDaのAE1は検出可能であるが、120kDaのバンドとして染色されるはずのAE2は検出できなかった。AE2のみを認識する抗体を現在作製中。

1)Separation of urine sediment cells: 20ml urine from patients with renal diseases (urinary tubule sex disorder, glomerulonephritis, kidney disease), 1500rpm,5 minutes of centrifugation, obtained urine sediment for 5ml of cold acid, added good washing, Percoll concentration matching remote center, large flat epithelium, small round urine tubule epithelial cells were separated. The former has to be isolated from DNA, the latter from RNA. 2) PCR and sequencing of protein 3: two kinds of protein 3 (AE1, AE2) were detected in the kidney, and the two kinds of protein 3 were cell specific and polar. The analysis of protein fragments in the development process is carried out in the PCR system, and the design is carried out in the optimization process. In the middle of the cDNA sequence, the structure of the cDNA sequence was analyzed. In the middle of the AE1 sequence, the alignment similarity of the cDNA sequence was analyzed. In the middle of the AE2 sequence, the cDNA sequence was analyzed. The PCR product of RNA gene was successfully amplified by PCR, including AE1 3.1kb and AE2 4.2kb. The DNA sequence of AE1 13kb, AE2 18kb, 3 ~ 5 kb, and 3 ~ 5 kb are all included in the sequence. Now AE2 needs to be matched to the correct position. The PCR is in progress. The PCR is in progress. Analysis of PCR products from patient origin, simultaneous analysis, and detection of abnormal AE1 in patients with urinary tubule disorders. 3) Analysis of H^+-ATPase and H2O2 complex: Acidification of urine and quantity of urine except for the exchange body of H2O2 and H2O2 complex; 2) Analysis of H2O2 complex: Further analysis of H2O2 complex. 4)Urethral epithelial cells were stained with SDS-PAGE, whole cell protein electrophoresis and immunostaining (detection of antibodies against AE1 C-terminal domain and anti-8.5K antibodies). About 100kDa AE1 may be detected, 120kDa AE2 may be detected. AE2 antibody is now in production.