バンド3関連蛋白質の淡白化学的分析と、各種疾患における発現

带 3 相关蛋白及其在各种疾病中表达的普通化学分析

• 批准号: 06772228
• 负责人: 大久保 研之
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06772228/
• 关键词: バンド3蛋白質; 関連蛋白質; 神経細胞; 蛋白化学的分析

1)バント3関連蛋白質の検出と精製すでに免疫組織染色法によってその存在を確認していたラット脳のバンド3関連蛋白質を、ウェスタンブロッティングによって更に確認した。主として染まる約40kDaのバンドは、ミトコンドリア、ミクロソーム、シナプトソームなどの膜分画に多く見られた。このタンパク質に注目し、精製を行った。ラット脳の膜分画を4%SDS/8M Ureaに可溶化し、ゲル濾過(TSK G-3000SW)にて粗分画に分け、逆相HPLC(Phenyl 5PW)でrichとなったフラクションを用いて、SDS-PAGEゲルからの切り出し、抽出を行った。切り出したタンパク質はさらに逆相HPLCで精製し、銀染色によっても、ウェスタンブロッティングによってもシングルバンドであることを確認した。精製したタンパク質の一次構造を決定する目的で、まず直接アミノ酸シークエンサーにかけたが、全くアミノ酸配列は得られず、N末端はブロックされていると考えられた(ブロックの性質については未解析)。内部一次構造を得るためにリジルエンドペプチダーゼや臭化シアンによる切断を行い、逆相HPLC(Cosmosil 5C8,Chemcosorb 300-7Dph)で分離できたペプチドを順次アミノ酸シークエンサーにかけた。得られた配列はデータベース検索(BLAST)を行ったが、既知のタンパク質ではないようである。現在、判明したアミノ酸配列からオリゴヌクレオチドを作製し、抗体と併せて、ラット脳のcDNA libraryのスクリーニングを開始している。2)各種病態におけるバンド3タンパク質ファミリーの変化尿沈渣中に存在する尿細管上皮細胞のバンド3タンパク質が、各種腎疾患において変化している(部分分解と考えられる)ことを,沈渣細胞のウェスタンブロッティングによって検出した。3)培養細胞におけるバンド3関連蛋白質PC12,MIN6,HepG2などの分泌系細胞について、ウェスタンロッティングを行ったところ、ラット脳で検出された40kDaのバンドが同様に検出され、他にも細胞の形態変化に相関するように発現されるいくつかのバンドが見られた。1)において精製したラット脳のタンパク質に対して抗体を作製し、これらの細胞でも染めてみる計画である。

1) Identification and purification of 3-related proteins and confirmation of their presence by immunohistochemical staining The main dye is about 40 kDa, and the membrane separation of the main dye is often observed. The quality of the product is high, and the product is refined. The membrane separation was performed by 4% SDS/8M Urea for solubilization, filtration (TSK G-3000SW) for crude separation, reverse phase HPLC(Phenyl 5PW) for rich separation, SDS-PAGE for extraction and extraction. The quality of the product was determined by reverse-phase HPLC. For the purpose of determining the primary structure of the refined product, it is necessary to directly remove the acid from the product, to remove the acid from the product, and to remove the acid from the product. Internal primary structure: separation by reverse phase HPLC(Cosmosil 5C8,Chemcosorb 300-7Dph) Get a list of all the information you need (BLAST), and get a list of all the information you need. Now, it is clear that the cDNA library of the antibody, antibody, and antibody has been selected from the list of genes. 2)All kinds of pathological changes in the urine sediment, urine tubule epithelial cells in the urine sediment, various kidney diseases in the middle of the transformation (partial decomposition and examination), sediment cells in the urine sediment, the detection of the change. 3)In cultured cells, the 40-kDa protein was detected in secretory cells of PC12, MIN6, and HepG2, and was found in other cells related to morphological changes of other cells. 1) The preparation of antibodies and the preparation of cells for purification.