cyclic ADP-ribose合成・分解酵素の活性発現に必須な一次構造の解明

阐明环状 ADP-核糖合成/降解酶活性表达所必需的一级结构

• 批准号: 07680644
• 负责人: 那谷 耕司
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07680644/
• 关键词: CD38; cyclic ADP-ribose; ADP-ribosyl cyclase; cyclic ADP-ribose hydrolase; 細胞内情報伝達物質; カルシウムイオン; site-directed mutagenesis; クローニング

研究代表者らが新しく見出した細胞内情報伝達物質cyclic ADP-ribose (cADPR)は、リンパ球の表面抗原であるCD38により合成・分解される。本研究の目的は、cADPR合成・分解酵素(CD38)の活性発現に必須な一次構造を明らかにすることである。平成7年度の研究計画は、計画どおりに進行し、以下の様に期待された成果が得られた。1.ヒト、ラット、マウスのCD38のアミノ配列および研究代表者らが決定したアメフラシのcADPR合成酵素のアミノ酸配列(Gene158, 213-218, 1995)を比較した結果、アメフラシ酵素に存在する10個のシステイン(Cys)がCD38でも保存されていた。この10個のCys以外にCD38間ではさらに2個のCysが保存されており、アメフラシ酵素ではこれら2個のCysに対応する配列はリジン(Lys)とグルタミン酸(Glu)であることが明らかとなった。2.研究代表者らはすでにヒトインスリノーマ由来のRNAを鋳型にしたPCR法によりヒトCD38 cDNAを、アメフラシ卵精巣のcDNAライブラリーよりcADPR合成酵素のcDNAを単離しているので、CD38およびアメフラシ酵素のcDNAの1.で同定した領域に、site-directed mutagenesisの手法を用いて変異を導入した。3.変異を導入したCD38およびアメフラシ酵素のcDNAをpSV2ベクターに組み込んだ後COS-7細胞に導入して、変異を持った酵素をCOS-7細胞に発現させた。4.ウェスタンブロット法により、変異cDNAを導入したCOS-7細胞中に酵素タンパクが発現していることを確認した。5.^<32>Pで標識したNADおよびcADPRを基質に、AG-MP1カラムを用いたHPLC法でcADPRの減少とADP-riboseの増大を指標にして、変異cDNAを導入したCOS-7細胞のホモジェネート中の酵素活性を測定した。その結果、CD38でのみ保存されている2個のCysをそれぞれLys, Gluに変異させたCD38はcADPR分解活性を失い、合成活性のみを示した。またアメフラシ酵素のLys, GluをどちらもCysに変異させると、アメフラシ酵素はcADPR合成活性に加えて分解活性も有するようになった。(Diabetes 1994, 244-246, 1995)6.研究代表者らはヒトCD38遺伝子を単離しその構造及び染色体座位を決定した(Cytogenetics and Cell Genetics, 69, 38-39, 1995)が、その結果ヒトCD38遺伝子からは選択的スプライシングによって上記の2個のCysを欠く変異体が生じることが明らかになった。この変異体のcDNAをCOS-7細胞に発現させたところ、cADPR合成・分解活性は認められなかった。以上の結果から、CD38の2個のCysがcADPR合成・分解活性に必須であることが明らかになった。

The research representative found that the intracellular information transfer substance cyclic ADP-ribose (cADPR) was synthesized and decomposed by CD38. The purpose of this study was to clarify the primary structure of cADPR synthase (CD38) for its activity. The research plan for Heisei 7 is under way, and the results are expected to be achieved. 1. Comparison of CD38 gene sequences (Gene158, 213-218, 1995) with CD38 gene sequences (Gene158, 213-218, 1995) determined by the representative researchers showed that CD38 gene sequences were conserved among 10 different gene sequences (Cys). In addition to these 10 Cys, CD38 contains 2 Cys that are stored in the same cell, and 2 Cys that are stored in the same cell are stored in the same cell. 2. Research representatives are interested in the development of a novel method for RNA typing, PCR, CD38 cDNA, CD38 cDNA, and site-directed mutagenesis. 3. The cDNA of CD38 gene was introduced into COS-7 cells and the cDNA of CD38 gene was expressed in COS-7 cells. 4. It was confirmed that the enzyme TANANPKO was detected in COS-7 cells when the mutant cDNA was introduced into COS-7 cells by the "TANANPKO" method. 5.^ <32>The enzyme activity in COS-7 cells was measured by HPLC for the reduction of cADPR and the increase of ADP-ribose. As a result, CD38 was preserved in two different ways, namely, Lys and Glu. CD38 was found to be deficient in cADPR decomposition activity and deficient in synthesis activity. Lys, Glu, Cys, Cys (Diabetes 1994, 244-246, 1995)6. Representative of the study on the structure and chromosome locus determination of CD38 gene (Cytogenetics and Cell Genetics, 69, 38-39, 1995). The expression of cADPR in COS-7 cells was investigated. The above results show that CD38 and 2 Cys are required for cADPR synthesis and decomposition activity.

项目成果

Shin Takasawa: "Requirement of calmodulin-dependent protein kinase II in cyclic ADP-ribose-mediated intracellular Ca2+ mobilization." Journal of Biological Chemistry. 270. 30257-30259 (1995)

Shin Takasawa：“环 ADP 核糖介导的细胞内 Ca2 动员需要钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II。”

東郷 暁: "ATPは直接CD38に作用してcyclic ADP-ribose分解活性を抑制する" 糖尿病. 39 (in press). (1996)

Akira Togo：“ATP 直接作用于 CD38 以抑制环 ADP-核糖降解活性”糖尿病 39（出版中）。

古谷保人: "ラットcyclic ADP-ribose合成酵素関連遺伝子産物BST-1の構造と発現" 生化学. 67. 697-697 (1995)

Yasuto Furuya：“大鼠环ADP核糖合酶相关基因产物BST-1的结构和表达”生物化学67. 697-697 (1995)。

高沢 伸: "膵β細胞小胞体からのcyclic ADP-riboseによるCa^<2+>放出のCaM kinase IIによる増強" 糖尿病. 39 (in press). (1996)

Shin Takazawa：“CaM激酶II介导的由胰腺β细胞内质网中的环状ADP-核糖诱导的Ca 2+ 释放增强”糖尿病39（出版中）。

池端史子: "糖尿病患者における抗CD38 (cyclic ADP-ribose合成・分解酵素)自己抗体の存在" 糖尿病. 39 (in press). (1996)

Fumiko Ikebata：“糖尿病患者中抗 CD38（环状 ADP-核糖合成/降解酶）自身抗体的存在”糖尿病 39（出版中）。