新規な銅シャペロンの探索・機能解析と応用

新型铜伴侣蛋白的搜寻、功能分析及应用

• 批准号: 14655302
• 负责人: 中山 亨
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14655302/
• 关键词: シャペロン; オーロン; フラボノイド; 銅; 翻訳後修飾; プロセシング; ポリフェノール; オキシダーゼ

銅シャペロンと推定されるタンパク質と相同性のあるORF遺伝子AmDDを含むcDNAが単離した.AmDDのアミノ酸配列解析により,54-110位および136-178位の2ヶ所にheavy metal associated domainの保存配列とよく一致する領域が存在することが分かった.これらを踏まえて,AmDDがCuの取り込みを補助し,AmAS1の活性化に関与するのではないかと推定した.pESC Yeast Epitope Tagging vectorを用いて,AmAS1とAmDDを共発現するプラスミドを構築した.AmDDまたはAmAS1の一方のみを含むプラスミド(pESC-DD,pESC-ASfull,pESC-ASΔN,pESC-ASΔC,pESC-ASΔNC)で形質転換した酵母をコントロールとして,共発現プラスミド(pESC-DD-ASfull,pESC-DD-ASΔN,pESC-DD-ASΔC,pESC-DD-ASΔNC)で形質転換した酵母の破砕液を粗酵素として,酵素アッセイを行った.しかし,コントロールと比較して反応生成物の顕著なピークを検出することはできなかった.粗酵素液の添加量および反応時間を増やしても,同様の結果が得られた.抗AmAS抗体を用いたウェスタンブロット発現解析を行った結果,発現タンパクの推定分子量(AmAS1 full;64kDa,AmAS1ΔN;57kDa,AmAS1ΔC;47kDa,AmAS1ΔNC;41kDa)と一致した単一のバンドを検出することができ,目的のタンパク質が発現していることが確認できた(Data Not Shown).ただし,SDS-PAGEで分析した後,クマシー染色を行ったところ,コントロールと比較して顕著なバンドの差は見られなかった.

The ORF sequence AmDD contains a single cDNA sequence.AmDD contains two heavy metal associated domain at positions 54 -110 and positions 136-178. AmDD supports Cu selection, AmAS1 activation, AmAS1 activation, AmAS1 activation (pESC-DD,pESC-ASfull,pESC-ASΔN,pESC-AS ΔC, pESC-AS Δ NC) is a yeast enzyme that can be transformed into a yeast enzyme. The product of the reaction is a mixture of the following: The addition amount of crude enzyme solution and reaction time were increased, and the same results were obtained. As a result of the analysis of anti-AmAS antibody detection, the estimated molecular weight of AmAS1 full;64kDa, AmAS1 ΔN;57kDa, AmAS1 ΔC;47 kDa, AmAS1 ΔNC;41kDa was found to be consistent with the detection of the target protein, and the identification of the target protein (Data Not Shown). After SDS-PAGE analysis, the staining was performed and the results were compared.

项目成果

Suzuki, H., et al.: "cDNA cloning and characterization of two Dendranthema × morifolium anthocyanin acyltrans ferases"Plant Science. 166. 89-96 (2004)

Suzuki, H., et al.：“两种 Dendranthema × morifolium 花青素酰基转移酶的 cDNA 克隆和表征”《植物科学》166. 89-96 (2004)。

Kurakova, L.et al.: "Improvement of thermostability of cold-active serine alkaline protease from the psychrotrophic bacterium"J. Mol. Cat. B : Enzymatic. (印刷中). (2003)

Kurakova，L. 等人：“冷活性丝氨酸碱性蛋白酶的热稳定性的提高”J.Cat.B：酶学。

Suzuki, H. et al.: "cDNA cloning, heterologous expressions, and functional characterization of malonyHltransferase"Plant Physiol.. 130. 2242-2151 (2002)

Suzuki, H. 等：“丙二酸基转移酶的 cDNA 克隆、异源表达和功能表征”Plant Physiol.. 130. 2242-2151 (2002)

Hemmi, H. et al.: "Change of product specificity of hexaprenyl diphosphate synthase from Sulfolobus solfataricus"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 297. 1096-1101 (2002)

Hemmi, H. 等人：“来自硫磺硫化叶菌的六异戊二烯基二磷酸合酶的产物特异性的变化”Biochem。

Noguchi, A., et al.: "Altering the substrate chain-length specificity of an α-glucosidase"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 304. 684-690 (2003)

Noguchi, A., et al.：“改变 α-葡萄糖苷酶的底物链长度特异性”Biochem.Biophys.Res.Commun.. 304. 684-690 (2003)