新規な銅シャペロン(PPOシャペロン)遺伝子の探索と機能解析

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キンギョソウの花弁の色の違いによるcDNAライブラリーの差し引き(黄色-白色)により単離した多数の黄色花弁特異的cDNAについて塩基配列を決定した.その塩基配列からそのcDNAの機能を推定するとともに,有望とされたクローンについては大腸菌の菌体内で大量発現させた.一方,黄色キンギョソウのオーレウシジンシンターゼAmAS1遺伝子をベイトとして,酵母Two-hybrid法によりAmAS1と相互作用する可能性のあるタンパク質をコードする遺伝子の数々をキンギョソウ花弁cDNAライブラリーから探索した.その結果,以前の研究でも銅シャペロンと推定されたタンパク質AmDDを含むcDNAが単離された.AmDDのアミノ酸配列解析により,54-110位および136-178位の2ヶ所にheavy metal associated domainの保存配列とよく一致する領域が存在することが分かった.このことから,AmDDがCuを結合してのAmAS1への取り込みを補助し,AmAS1の活性化に関与する銅シャペロン(PPOシャペロン)どして機能する可能性が示唆された.次いで,AmDDの機能を生化学的に証明するため,この遺伝子を酵母細胞内でaureusidin synthase遺伝子と共発現させた.形質転換酵母細胞の細胞抽出液についてテトラヒドロキシカルコンを基質としてaureusidin synthase活性をアッセイした.しかしながら予想に反して細胞抽出液中にぽ有意な同酵素漕性は見いだされなかった.以上の結果から,AmAS1への銅の取り込みにはAmDD以外の因子の関与についても検討する必要があると考えられた.