麻薬耐性成立におけるノシセプチン受容体の関与に関する分子生物学的研究

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クローン化したcDNAを鋳型として、PCR法により、オピオイド受容体あるいはノシセプチン受容体蛋白のN末端にtag (hemaggulutinin、FLAG、c-mycなどのアミノ酸配列を有する抗体認識部位)を連結した蛋白をコードするcDNAを合成し、培養細胞に発現させるためのプラスミドに組み込んで、発現ベクターを作成した。発現ベクターを単独で、あるいは組み合わせて、培養細胞(CHOあるいはHEK293)に導入した。オピオイド受容体とノシセプチン受容体の両者を発現する細胞を用い、tagに対する抗体を用いた免疫沈降法とimmunoblot法の組み合わせにより、両受容体の複合体の検出を試みた。種々の条件検討を行ったが、複合体形成は少量であった。ノシセプチン受容体およびオピオイド受容体のアゴニストあるいはアンタゴニストの結合親和性をリガンド結合実験により評価した。両受容体のアゴニストの存在が、他の受容体のリガンド結合親和性に及ぼす影響について検討したが、有意の変化は認めなかった。以上の結果は、両受容体はアミノ酸配列の相同性が高いにもかかわらず、複合体形成の効率は低く、互いの受容体機能に及ぼす影響は少ないことを示唆している。オピオイド受容体のアミノ酸配列上で糖鎖付着が推測されるアミノ酸残基を置換した変異受容体を作成した。これらの受容体の分子量を電気泳動により評価すると、糖鎖に相当する分の分子量が減少していることが示された。しかしながら、これらの変異導入はリガンド結合特性の変化を惹起せず、リガンド結合能に対する糖鎖の関与は少ないことが示唆された