アデノウイルスベクターを用いたアポトーシス抑制分子発現による移植腎拒絶回避の試み

尝试通过腺病毒载体表达凋亡抑制分子来避免移植肾的排斥反应

• 批准号: 14657404
• 负责人: 高橋 公太
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Niigata University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14657404/
• 关键词: XIAP; adenovirus vector; 尿細管上皮細胞; 移植腎; 急性拒絶反応; apoptosis; adnovirus vector

X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP)は細胞のapoptosis実行分子であるprotease ; caspase-3及び-7のubiquitinationとproteasomal degradationを直接行っており、細胞の生存に深く関わる分子である。(1)XIAPのcloning:腎癌細胞株ACHNよりtotal RNAを抽出し、2組のprimerを用いたRT-PCR法にて、XIAPのcloningを行った。それぞれ1601bpと1651bpのproductが得られ、XIAPのsequenceであることが確認された。(2)XIAP発現ベクターの作成:XIAP PCR product (1601bp)のPtargeT mammalian expression vector (Promega社)へのligationを行った。これを、E.coliにtransformし培養後、plasmidを回収した。Sequenceの結果、misincorporationのないXIAP発現ベクターが得られた。(3)XIAPの導入:electroporationにて、XIAP発現ベクターを尿細管由来293細胞株へ導入した。Immunoblottingにて、これらのXIAP transfectantantは、通常の293細胞やPtargeTのみを導入した293細胞に比較し、有意なXIAP蛋白の発現増加を認めた。(4)XIAP導入効果:われわれはXIAP antisense oligonucleotideを用いた膀胱癌細胞株に対するapoptosisの誘導とこの系におけるBcl-2の発現の減弱を報告した。今回XIAP発現ベクターを導入系で種々のapoptosis刺激による関連分子の推移、Feedback-loopの解析をおこない、apoptosis耐性を示唆する知見を得た。このことは移植腎急性拒絶反応における尿細管細胞のapoptosis耐性誘導による移植腎障害回避に本法が臨床応用可能であることを示唆する。

X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) is a molecular marker for apoptosis in cells; caspase-3 and caspase-7 ubiquitination and proteasomatic degradation are directly involved in apoptosis and cell survival. (1)XIAP cloning: total RNA was extracted from renal cell carcinoma cell line ACHN, and two sets of primers were used for RT-PCR and XIAP cloning. The 1601bp and 1651bp sequences were identified. (2) The preparation of the XIAP discovery event: the inspection of the XIAP PCR product (1601bp) and the PtargeT mammalian expression vector (Promega) will be carried out. After E.coli transformation, the plasmid was recovered. Sequence of results, misincorporation of XIAP found in the search results. (3) Introduction of XIAP:Electroporation, XIAP development, urine tubule origin, 293 cell line introduction. Immunoblotting, the introduction of XIAP transfectant into 293 cells and the introduction of PtargeT into 293 cells were investigated. (4) The effect of XIAP introduction: the expression of Bcl-2 was reduced in bladder cancer cell lines induced by XIAP antisense oligonucleotide. This paper reports the discovery of XIAP, the molecular evolution, the analysis of Feedback-loop, and the expression of apoptosis resistance in the introduction system. This method may be clinically useful for acute rejection of kidney transplants and for induction of renal tubular cell apoptosis.