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P2X受容体発現細胞を用いた脳組織細胞外ATP放出イメージング法の開発

使用 P2X 受体表达细胞开发脑组织细胞外 ATP 释放成像方法

基本信息

批准号：
15650071
负责人：
加藤総夫
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Jikei University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

脳組織におけるATPの細胞外放出をイメージングによって検証することが本研究の目的であった。昨年度、P2X_2受容体を発現させたHEK293T細胞がATP変化を検出し得るか検討したが、投与された外因性ATPに対する応答は長く持続的で、時間的な分解能が著しく低いこと、また、細胞間の発現効率の差のために十分な空間分解能が得られないことが判明した。以上より、細胞外代謝の速いATP濃度の変化を画像化するには、この方法は不適切であると結論した。そこで、本年度は新しい二つの試みを計画し実行した。第1は、超高感度光子検出カメラとluciferin-luciferase反応を用いて脳スライスにおける細胞外ATPを検出する試みである。海馬、大脳皮質、孤束核スライスにおいて電気刺激によるATP放出を画像化し得た。電気刺激による細胞外ATP濃度上昇は、(1)刺激電極の近傍に限局し、軸索終末近傍では観察されない、(2)テトロドトキシンによって消失しない、そして、(3)高K+濃度刺激によっては生じないことが明らかになった。これらは、脳スライスで電気刺激によってATPが放出されるとする現在までの報告の多くに重大な疑義を投げかける重要な結果である。第2は、バイオセンサーを用いた脳組織内局所的ATP濃度のリアルタイム計測である。同センサーは、2004年度までは開発国イギリス国内でしか使用できないという特許規定があったこと、また、開発者がヴェンチャー企業を設立し輸入手続に時間がかかったことなどから、研究代表者のもとに同センサーが届いたのは2005年1月であった。現在、同センサーを用いた脳スライスにおける細胞外ATP計測の実験を進行中である。以上より、本萌芽研究の目的は、当初の実験手法を変更したが、新たな方法を漸次採用することによって果たされ、萌芽段階ではない研究に進展しつつある。

The purpose of this study is to investigate the extracellular release of ATP from tissues. In the past year, P2X_2 receptor expression and HEK293 T cell ATP production were detected, and the response to exogenous ATP was long-lasting. The temporal decomposition energy was low, and the difference in cell expression efficiency was very high. The above results indicate that this method is not suitable for the characterization of ATP concentration in extracellular metabolism. This year's new plan was implemented. First, ultra-high sensitivity photon detection and Luciferin-Luciferase reaction in the middle of the cell, extracellular ATP detection. Hippocampus, large cortex, nucleus fascicularis solitarii, ATP release, electrical stimulation, imaging. The increase of extracellular ATP concentration due to electrical stimulation is caused by: (1) the limitation of the near side of the stimulation electrode and the observation of the near side of the axonal terminal;(2) the disappearance of the near side of the stimulation electrode;(3) the increase of ATP concentration due to high K+ concentration stimulation. This report contains a number of significant questions regarding the release of ATP due to electrical stimulation. The second is the measurement of ATP concentration in the tissue. In 2004, the company was founded in 1998, and the company was founded in 1999. The measurement of extracellular ATP is currently in progress. The purpose of this research is to improve the original methods and to adopt new methods gradually.