脳内シナプス前神経伝達物質放出関連分子の遺伝子導入および発現阻害法の確立

脑内突触前神经递质释放相关分子基因导入及表达抑制方法的建立

基本信息

批准号：
17650116
负责人：
加藤総夫
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Jikei University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、脳内シナプス前神経細胞への遺伝子導入およびタンパク質発現阻害の方法を確立することであった。この目的は達成され、極めて効率的なin vivo神経節遺伝子発現制御法を確立した。本法は以下の3段階からなる。1.頚部節状神経節への高効率核酸導入麻酔下に頚部節状神経節を露出し、神経節鞘内に核酸溶液を注入後、電気穿孔法によって細胞内に導入した。その結果、最適導入条件下、無視しうるほど僅かな細胞障害で約85%の細胞に核酸を導入することに成功した。2.節状神経節における導入遺伝子発現およびノックダウンの効果の評価核酸導入2-15日後に麻酔下に節状神経節を摘出した。EGFP遺伝子導入群においては、多くの細胞におけるEGFP発現を確認した。また、siRNA導入群においては、遺伝子ノックダウンの標的としてシナプス前で伝達物質放出を抑制するアデノシンA_1受容体の遺伝子を選び、導入の3-12日間持続するアデノシンA_1受容体mRNA量の有意な減少をreal-time RT-PCR法により確認した。この減少は対照のタンパクmRNAにおいては認められず、また、ランダム配列siRNAや溶液のみを導入した群においても認められなかった。3.延髄孤束核におけるシナプス前分子発現抑制効果の評価siRNA導入の11-15日後、孤束核2次ニューロンから記録された孤束1次求心線維刺激誘発シナプス後電流に及ぼすアデノシン(100μM)の効果が有意に減弱した。この減少は、ランダム配列siRNA・溶液導入群においては認められなかった。以上より、節状神経節における遺伝子発現ノックダウンによって、極めて効率的なシナプス前分子機能阻害が可能であることが証明され、その方法が確立された。本法の細部を記した論文を現在投稿準備中であり、公表後は脳科学の進展に大いに貢献すると期待される。

这项研究的目的是建立基因转移到大脑中突触前神经元并抑制蛋白表达的方法。实现了这一目标，并建立了一种非常有效的控制神经节基因表达的方法。该方法由三个阶段组成：1。高效的核酸引入宫颈神经节中宫颈神经节在麻醉下暴露，并将核酸溶液注入神经节鞘中，然后通过电穿孔将其引入细胞。结果，它成功地将核酸引入了最佳转导条件下约85％的细胞中，并且可以忽略不计细胞损伤。 2。评估基因神经节中的转基因表达和敲低的作用。在核酸引入后2-15天，在麻醉下切除了淋巴结神经节。在EGFP转染组中，确认了许多细胞中的EGFP表达。在siRNA传递组中，在选择突触之前抑制发射机释放的腺苷A_1受体的基因作为基因敲低的靶标，而实时RT RT-PCR证实了持续3-12天引入的腺苷A_1受体mRNA的量显着降低。在对照蛋白mRNA中未观察到这种降低，也没有在仅引入随机序列siRNA或溶液的基团中观察到它。 3。评估siRNA引入后11-15天，对突触前分子表达的抑制作用，腺苷（100μM）对从核刺激核刺激核刺激后记录的突触后电流记录的突触后电流的作用显着，是从核源源中的突触后记录的。在随机序列siRNA/溶液引入组中未观察到这种还原。从上面的情况下，已经证明，基因表达在淋巴结神经节中可以极有效地抑制突触前分子功能，并且已经建立了一种方法。一篇论文详细介绍了该法律目前正在准备提交的论文，并且一旦发布，它将有望为脑科学的发展做出巨大贡献。