2つの基質結合部位を持つ酵素の蛋白質工学的解析

具有两个底物结合位点的酶的蛋白质工程分析

• 批准号: 08680684
• 负责人: 倉光 成紀
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08680684/
• 关键词: 酵素反応機構; 基質特異性; 一酵素二基質; 疎水性基質認識; 酵素工学; 高度好熱菌; 疎水性相互作用; 蛋白質工学

アミノ基転移酵素は2つのアミノ酸基質間のアミノ基転移反応を触媒する。大腸菌アスパラギン酸アミノ基転移酵素(AspAT),芳香族アミノ酸アミノ基転移酵素(AroAT),分岐鎖アミノ酸アミノ基転移酵素(BCAT)などは,酸性基質に対する反応性は似かよっているが,疎水性基質に対する反応性は異なっている。蛋白質工学的解析より,これらの酵素は酸性基質用と疎水性基質用の2つの基質結合ポケットを持ち,基質によって2つのポケットを使い分けていることが明らかになった。このように2つの性質の異なる基質結合ポケットを使い分けるのは,アミノ基転移酵素のみならず,転移酵素一般に広く使われている酵素設計原理と考えられる。この「1酵素-2基質」酵素の分子設計原理を詳細に解析するために,立体構造および機能解析に適した高度好熱菌Thermus thermophilus HB8由来のAspATの遺伝子をクローニングし,DNAの塩基配列を決定し,酵素量産化のためのプラスミドを構築した。精製して得られた高度好熱菌AspATは非常に安定で,pH7では90℃まで安定であり,25℃ではpH2-12の領域で安定であった。この高度好熱菌AspATの分子全体の揺らぎは,常温生物の酵素よりも少ないことが明らかになった。常温生物のAspAT同様,塩基性の酸性基質結合用ポケットに,酸性基質のCOO^-が酵素結合した。ところが意外なことに,疎水性アミノ酸基質認識部位は,常温生物の疎水性基質結合部位よりも揺らぎが大きく,疎水性基質に対する基質特異性が広いことが明らかになった。このような疎水性基質に対する高度好熱菌酵素の広い特異性は,高度好熱菌の遺伝子数が常温生物よりもはるかに少なく,数少ない種類の酵素で多くの種類のアミノ酸のアミノ基転移反応を触媒する必要があるためと考えられる。

ア ミ ノ base planning は shift enzyme 2 つ の ア ミ ノ acid matrix between の ア ミ ノ base planning to move the 応 を catalyst す る. Coliform ア ス パ ラ ギ ン acid ア ミ ノ base planning enzyme (AspAT), aromatic ア ミ ノ acid ア ミ ノ base planning enzyme (AroAT), branching lock ア ミ ノ acid ア ミ ノ base planning shift enzyme (BCAT) な ど は, acidic matrix に す seaborne る anti 応 sex は like か よ っ て い る が, 疎 water-based matrix に す seaborne る anti 応 sex は different な っ て い る. Protein engineering analytical よ り, こ れ ら の enzyme は acid matrix with と 疎 water-based matrix with の 2 つ の matrix combining ポ ケ ッ ト を ち to have, matrix に よ っ て 2 つ の ポ ケ ッ ト を make い points け て い る こ と が Ming ら か に な っ た. こ の よ う に 2 つ の nature の different な る matrix combining ポ ケ ッ ト を make い points け る の は, ア ミ ノ base planning shift enzyme の み な ら ず, planning to move enzyme generally に hiroo く make わ れ て い る enzyme design principle と exam え ら れ る. <s:1> <s:1> "1 enzyme -2 matrix" enzyme <s:1> molecular design principle を detailed に analysis するために three-dimensional structure および functional analysis に suitable <s:1> た height thermophilic bacteria Thermus thermophilus HB8 origin の AspAT の posthumous son 伝 を ク ロ ー ニ ン グ し, DNA の salt base with column を し decision, enzyme production is changed の た め の プ ラ ス ミ ド を build し た. Refined し て have ら れ た highly hot bacteria AspAT は very に で, pH7 で は 90 ℃ ま で settle で あ り, 25 ℃ で は pH2-12 で の field stability で あ っ た. The entire molecule of the <s:1> <s:1> highly thermophilic bacterium AspAT <e:1> is らぎ らぎ, and the calczyme of the mesophilic organism is よ, な な, とが, min ら, になった, になった. In room-temperature organisms, similar to <s:1> AspAT, for basic <s:1> acidic substrates, ポケットに is used for binding, and for acidic substrates, <s:1> COO^-が enzyme is used for binding to た. と こ ろ が accident な こ と に, waterborne ア 疎 ミ ノ acid matrix は know place, under normal temperature biological の 疎 water-based matrix combining site よ り も 揺 ら ぎ が big き く, 疎 water-based matrix に す seaborne る substrate specificity が hiroo い こ と が Ming ら か に な っ た. こ の よ う な 疎 water-based matrix に す seaborne る highly hot bacteria enzyme の hiroo い specificity は, traces of highly hot bacteria の 伝 son number が room temperature biological よ り も は る か に less な く, less な い の enzyme で many く の kinds の ア ミ ノ acid の ア ミ ノ base planning to move the 応 を catalyst す る necessary が あ る た め と exam え ら れ る.

项目成果

Kawaguchi,S.: "New Concept of the Enzymatic Recognition of Hydrophobic Substrates" Protein Science. VOl.6(印刷中). (1996)

Kawaguchi, S.：“疏水底物酶促识别的新概念”蛋白质科学 VOl.6（出版中）。

倉光成紀(共著): "生化学辞典(第3版)" 東京化学同人,東京(印刷中), (1996)

Seiki Kuramitsu（合著者）：《生物化学词典（第 3 版）》东京化学同人，东京（印刷中），（1996 年）

Kawaguchi,S.: "Enzyme Flexibility : New Concept in Recognition of Hydrophobic Substrates" J.Biochem.(印刷中). (1996)

Kawaguchi, S.：“酶的灵活性：疏水性底物识别的新概念”J.Biochem.（出版中）。

Okamoto, A.: "An Aspartate Aminotransferase from an Extremely Thermophilic Bacterium, Thermus thermophilus HB8" J.Biochem.119 (No.1). 135-144 (1996)

Okamoto, A.：“来自极端嗜热细菌，嗜热栖​​热菌 HB8 的天冬氨酸转氨酶”J.Biochem.119（No.1）。

Kato,R.: "ATPase Activity of UvrB Protein from Thermus thermophilus HB8,and Its Interaction with DNA" J.Biol.Chem.271・No.16. 9612-9618 (1996)

Kato, R.：“嗜热栖热菌 HB8 的 UvrB 蛋白的 ATP 酶活性及其与 DNA 的相互作用”J.Biol.Chem.271·No.16（1996）。