肝線維化過程における伊東細胞の形質変換の機序

伊東細胞は筋線維芽細胞様に形質を変え、細胞外マトリックスを多量に産生する。しかし、その形質変換のマーカーがなく、この分野の研究の支障になっていた。我々は、伊東細胞に発現する未知蛋白のcDNAクローンを二種類(#72、#81)得ており、それらの発現状況より、形質転換のマーカーとなり得ると考えた。そこで、本年度はそれらの本体を明らかにすることを第一の目標として研究を進めた。1.分化段階を認識するマーカーの同定と抗体の作製:(1)cDNAクローニング:得ているcDNAは、蛋白の全長をコードするものではないため、再スクリーニングを行っている。#72(約2kbのmRNAに対応)に関しては、最長1050bpのcDNAを得ている。#81(約3kbのmRNAに対応)では、スプライシングの違いによると考えられる二種類のcDNAを得た。それぞれ最長1914,1981bpで、3'側の共通部分は1534bpであった。しかし、開始コドンは未だ得られていない。(2)抗体の作製:cDNAから予測されるアミノ酸配列のN端10アミノ酸残基のペプチドを合成し、ウサギに免疫した。#72に対する抗血清が得られ、その性状を検討中である。しかし、#81に対する抗体は誘導されず、他の抗原性のあると予測される部分のペプチドを用い、再度ウサギを免疫している。また、合成ペプチドを用いた抗体はタイターが、比較的低いため、cDNAを発現ベクターpGEXにサブクローニングし、大腸菌に発現させたリコンビナント蛋白を用いての抗体作製も試みている。2.今後の予定:上記の実験の結果得られるcDNAや抗体を用いと、各種病態下の伊東細胞におけるこれらの蛋白の発現を、肝マクロファージにおける各種サイトカインの発現との比較で検討する。また、培養伊東細胞を用いて、新しいマーカーの発現に対するサイトカインの影響を検討する。

伊東細胞は筋線維芽細胞様に形質を変え、細胞外マトリックスを多量に産生する。しかし、その形質変換のマーカーがなく、この分野の研究の支障になっていた。我々は、伊東細胞に発現する未知蛋白のcDNAクローンを二種類(#72、#81)得ており、それらの発現状況より、形質転換のマーカーとなり得ると考えた。そこで、本年度はそれらの本体を明らかにすることを第一の目標として研究を進めた。1.分化段階を認識するマーカーの同定と抗体の作製:(1)cDNAクローニング:得ているcDNAは、蛋白の全長をコードするものではないため、再スクリーニングを行っている。#72(約2kbのmRNAに対応)に関しては、最長1050bpのcDNAを得ている。#81(約3kbのmRNAに対応)では、スプライシングの違いによると考えられる二種類のcDNAを得た。それぞれ最長1914,1981bpで、3'側の共通部分は1534bpであった。しかし、開始コドンは未だ得られていない。(2)抗体の作製:cDNAから予測されるアミノ酸配列のN端10アミノ酸残基のペプチドを合成し、ウサギに免疫した。#72に対する抗血清が得られ、その性状を検討中である。しかし、#81に対する抗体は誘導されず、他の抗原性のあると予測される部分のペプチドを用い、再度ウサギを免疫している。また、合成ペプチドを用いた抗体はタイターが、比較的低いため、cDNAを発現ベクターpGEXにサブクローニングし、大腸菌に発現させたリコンビナント蛋白を用いての抗体作製も試みている。2.今後の予定:上記の実験の結果得られるcDNAや抗体を用いと、各種病態下の伊東細胞におけるこれらの蛋白の発現を、肝マクロファージにおける各種サイトカインの発現との比較で検討する。また、培養伊東細胞を用いて、新しいマーカーの発現に対するサイトカインの影響を検討する。