肝実質細胞機能の細胞外マトリックスによる調節機構の解明

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肝細胞外マトリックスに対する膜受容体と想定した未知の蛋白の全塩基配列決定及び機能解明を第一目標とした。1.全塩基配列の決定:本蛋白は、7Kb以上のmRNAに対応することが判明しており、以下の2方法にて解析している。(1)cDNAライブラリーの再スクリーニング:獲得した部分cDNAの5'端をプローブとして、ライブラリーの再スクリーニングを繰り返し、最長2893bpのクローンを得た。(2)One-sised PCR法:決定した塩基配列を基に、その5'および3'端に対応するプライマーを作製し、各方向への延長を行っている。2.特異抗体の作製:予測されるアミノ酸配列より、抗原性の高い部分を数ケ所選び、15残基のペプタイドを合成し、ウサギに免疫を行っているが、いまだ有用な抗体は得ていない。また、cDNAを用いてリコンビナント蛋白を大腸菌で調整し、これを用いた抗体の作製も試みている。3.機能の解明:塩基配列及び予想されるアミノ酸配列を用いてコンピュータ解析を行った。塩基レベルでは既知のものと有意なホモロジーはなかった。5'側の約1kb部分の予測されるアミノ酸配列は、各種プロテインキナーゼの活性ドメインと30〜40%のホモロジーを示した。このドメインは、プロテインキナーゼ活性ドメインのconserved motifsのすべてを有し、活性中心はセリン/スレオニンプロテインキナーゼに特異的なconsensus patternを示した。系統樹による検討からは既知のプロテインキナーゼとは異なる群に属すると考えられた。一方、3'側の約1.8KbのcDNAでコードされるペプタイドは、大部分がcoiled coil構造を形成すると推定された。4.今後の予定:本蛋白はプロテインキナーゼ活性ドメインを有することから、分子間の情報伝達に関与すると推定され、これが細胞と細胞外マトリックスとの相互作用にどの様な役割を担うかを検討する。