母体末梢血より胎児細胞を分離するサスペンション蛍光ハイブリダイゼーション法の確立

1.ビオチン標識Y‐染色体特異的DNAプローブの作製ヒトY‐染色体長腕上の特異的な繰り返し配列(DYZ1)をpolymerase chain reaction(PCR)により増幅し、精製した後、異なる濃度のビオチン‐11‐dUTP存在下にさらにPCRによる増幅を行い、ビオチン標識DNAプローブを作製した。これらのビオチン標識DNAプローブの標品について、男性ならびに女性末梢血より分離した単核細胞を用いて、スライド上にスプレッドしたインタフェース細胞のin situ蛍光hybridization(FISH)をstreptoavidin‐FITCにて行い、プローブ作製の条件とhybridizationの条件を検討した。その結果、バックグランドの蛍光がやや強いが、特異性の点では使用に供しえるビオチン標識Yプローブ標品を得た。2.懸濁細胞核の調製法の検討次に、末梢血単核細胞をデタージェント処理して得られる核について、アルコールによる脱水、酸処理による蛋白除去、アルデヒドによる固定の一連の操作をすべて懸濁状態で行い、後のFISHを懸濁液にて可能とする細胞核調製法の確立を試みた。これには、各種のデタージェント、アルコールや酸の種類と濃度、および遠心分離の操作などについて条件を組み合わせ広範な検討を行った。しかし、これまで試みたいずれの条件においても、核の回収はあまり良好でなく、しかも、調製が進むにつれて核は粘着・凝集し、単一核の分散系を得るまでには至らなかった。今回の萌芽的研究で目指した母体末梢血より胎児細胞を分離するsuspension蛍光hybridization法の確立のためには、hybridizationを可能とする懸濁細胞核を単一核の分散系として調製することが必須であり、引き続きそのための検討を行っている。

1.ビオチン標識Y‐染色体特異的DNAプローブの作製ヒトY‐染色体長腕上の特異的な繰り返し配列(DYZ1)をpolymerase chain reaction(PCR)により増幅し、精製した後、異なる濃度のビオチン‐11‐dUTP存在下にさらにPCRによる増幅を行い、ビオチン標識DNAプローブを作製した。これらのビオチン標識DNAプローブの標品について、男性ならびに女性末梢血より分離した単核細胞を用いて、スライド上にスプレッドしたインタフェース細胞のin situ蛍光hybridization(FISH)をstreptoavidin‐FITCにて行い、プローブ作製の条件とhybridizationの条件を検討した。その結果、バックグランドの蛍光がやや強いが、特異性の点では使用に供しえるビオチン標識Yプローブ標品を得た。2.懸濁細胞核の調製法の検討次に、末梢血単核細胞をデタージェント処理して得られる核について、アルコールによる脱水、酸処理による蛋白除去、アルデヒドによる固定の一連の操作をすべて懸濁状態で行い、後のFISHを懸濁液にて可能とする細胞核調製法の確立を試みた。これには、各種のデタージェント、アルコールや酸の種類と濃度、および遠心分離の操作などについて条件を組み合わせ広範な検討を行った。しかし、これまで試みたいずれの条件においても、核の回収はあまり良好でなく、しかも、調製が進むにつれて核は粘着・凝集し、単一核の分散系を得るまでには至らなかった。今回の萌芽的研究で目指した母体末梢血より胎児細胞を分離するsuspension蛍光hybridization法の確立のためには、hybridizationを可能とする懸濁細胞核を単一核の分散系として調製することが必須であり、引き続きそのための検討を行っている。