耐熱性色素依存性D-乳酸脱水素酵素の機能・構造解析とバイオセンサー素子への応用

热稳定性染料依赖性 D-乳酸脱氢酶的功能和结构分析及其在生物传感器元件中的应用

• 批准号: 17H07257
• 负责人: 林 順司
• 金额: $ 1.75万
• 依托单位: Ritsumeikan University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2017-08-25 至 2019-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17H07257/
• 关键词: 酵素工学; 酵素; 好熱菌; 構造生物学; 超好熱菌; 応用生物化学

本申請研究の目的は、立体構造情報を基にバイオセンサー素子として最適な色素依存性D-乳酸脱水素酵素（Dye-DLDH）を開発することである。本申請研究はD-乳酸の新規測定法開発において重要な役割を果たすと考えられる。当該年度は、Dye-DLDHホモログの検索・大腸菌における発現系構築・触媒活性の同定・酵素精製・結晶化スクリーニングを実施した。超好熱菌・好熱菌のゲノム情報に基づき機能が特定されていないDye-DLDHホモログの検索を行った結果、10種類以上のDye-DLDHの存在を推定した。これらをコードする遺伝子に関して、クローニングと大腸菌における発現系の構築を行い、好熱菌Geobacillus kaustophilusのホモログに関して可溶性画分への発現が認められた。触媒活性の同定はNative-PAGEを用いた活性染色法によって行った。その結果、発現遺伝子からDye-DLDH活性が得られた。各種クロマトグラフィーによって本酵素の精製を行い、電気泳動的にほぼ単一に精製することに成功した。本酵素の結晶化スクリーニングにも着手し、タンパク質と思われる結晶を得た。今後は、本結晶に関して結晶化の最適化条件を検討し、X線回折実験を行うことを予定している。また、本酵素の酵素化学的諸性質の解明を行い、バイオセンサー素子としての有用性を評価していく。さらに、発現に成功しなかったホモログに関しても発現系を再検討する。複数の酵素を比較することで、バイオセンサー素子として優れた酵素を選抜する。

The purpose of the present application is to develop an optimal pigment-dependent D-lactate dehydratase (Dye-DLDH) based on three-dimensional structural information. The present application studies the development of a new method for the determination of D-lactic acid. During the year, Dye-DLDH detection, Escherichia coli detection, and enzyme purification were performed. The basic function of Dye-DLDH is to determine the existence of more than 10 kinds of Dye-DLDH. The development of soluble protein in Escherichia coli and Geobacillus kaustophilus was studied. The activity of the catalyst was determined by Native-PAGE. The activity of Dye-DLDH was detected in all samples. A variety of enzyme purification, electrokinetic purification Crystallization of this enzyme is carried out in a variety of ways. In the future, the optimum conditions for crystallization of the present crystal are discussed and X-ray retrogradation is determined. In addition, the various properties of the enzyme chemistry of this enzyme are explained, and the usefulness of the enzyme support element and its synthesis is evaluated. The development system was reviewed for success. A comparison of enzymes is made between enzymes and enzymes.