耐熱性色素依存性D-乳酸脱水素酵素の機能・構造解析とバイオセンサー素子への応用

热稳定性染料依赖性 D-乳酸脱氢酶的功能和结构分析及其在生物传感器元件中的应用

• 批准号: 17H07257
• 负责人: 林 順司
• 金额: $ 1.75万
• 依托单位: Ritsumeikan University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2017-08-25 至 2019-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17H07257/
• 关键词: 酵素工学; 酵素; 好熱菌; 構造生物学; 超好熱菌; 応用生物化学

本申請研究の目的は、立体構造情報を基にバイオセンサー素子として最適な色素依存性D-乳酸脱水素酵素（Dye-DLDH）を開発することである。本申請研究はD-乳酸の新規測定法開発において重要な役割を果たすと考えられる。当該年度は、Dye-DLDHホモログの検索・大腸菌における発現系構築・触媒活性の同定・酵素精製・結晶化スクリーニングを実施した。超好熱菌・好熱菌のゲノム情報に基づき機能が特定されていないDye-DLDHホモログの検索を行った結果、10種類以上のDye-DLDHの存在を推定した。これらをコードする遺伝子に関して、クローニングと大腸菌における発現系の構築を行い、好熱菌Geobacillus kaustophilusのホモログに関して可溶性画分への発現が認められた。触媒活性の同定はNative-PAGEを用いた活性染色法によって行った。その結果、発現遺伝子からDye-DLDH活性が得られた。各種クロマトグラフィーによって本酵素の精製を行い、電気泳動的にほぼ単一に精製することに成功した。本酵素の結晶化スクリーニングにも着手し、タンパク質と思われる結晶を得た。今後は、本結晶に関して結晶化の最適化条件を検討し、X線回折実験を行うことを予定している。また、本酵素の酵素化学的諸性質の解明を行い、バイオセンサー素子としての有用性を評価していく。さらに、発現に成功しなかったホモログに関しても発現系を再検討する。複数の酵素を比較することで、バイオセンサー素子として優れた酵素を選抜する。

这项申请研究的目的是基于三维结构信息，开发依赖染料的D-乳酸脱氢酶（Dye-DLDH），作为生物传感器设备。该申请研究被认为在测量D乳酸的新方法中起着重要作用。在今年，进行了染色 - dldh同源物，大肠杆菌中表达系统的构建，催化活性，酶纯化和结晶筛选的鉴定。我们搜索了基于高疗细菌和嗜热细菌的基因组信息，未指定其功能的染料 - dldh同源物，并估计存在10种以上类型的染料dLDH。编码它们的基因是克隆的，并且在大肠杆菌中构建了表达系统，并在可溶性馏分中观察到了嗜热细菌geobacillus kaustophilus的表达。通过使用天然页面进行主动染色来鉴定催化活性。结果，从表达的基因获得染料 - dldh活性。通过各种色谱纯化酶，并将酶成功纯化为几乎单个电泳。我们还开始对这种酶进行结晶的筛选，并获得了似乎是蛋白质的晶体。将来，我们计划研究该晶体结晶的优化条件，并进行X射线衍射实验。此外，将阐明该酶的酶化学性质，并将评估其作为生物传感器元件的有用性。此外，将对未成功表达的同源物进行审查。通过比较多种酶，将出色的酶选择为生物传感器元件。