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気管支喘息患者の白血球5-LipoxygenaseのmRNAの一次構造異常の検討

支气管哮喘患者白细胞5-脂氧合酶mRNA初级结构异常的检测

基本信息

批准号：
06670481
负责人：
越野健
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Research Institute, International Medical Center of Japan
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06670481/
关键词：
白血球5-Lipoxygenase mRNA PCR IgE 好塩基球

项目摘要

第一に、ヒト精製白血球分画における5-Lipoxygenase mRNAの発現レベルをPCR法によって半定量する条件について検討した。ヒト5-Lipoxygenase cDNA配列をもとに、センスオリゴマー、アンチセンスオリゴマーを合成し、プライマーとして使用した。ヒト全血よりグルコース・デキストラン法にて白血球分画を精製し、インビトロジェン社のMicro Fast Track mRNA purification kitによりmRNAを抽出し、逆転写反応を行いcDNAとし、テンプレートに用いた。プライマーのアニールに適する温度を30サイクルのPCRにて検討した結果、54℃近辺が適当であった。このアニール温度にてPCRによる増幅がプラトーに達するサイクルを検討したところ、8〜20サイクルの間では急峻に増幅が進み、24サイクル前後で飽和することを観察した。以上の結果より、アニール温度54℃にて20サイクルのPCRを行うことで、5-LipoxygenaseのmRNA発現レベルを半定量できるとこが判明した。次に、精製したヒト白血球をカルシウムイオノフォアで刺激し、5-Lipoxygenase mRNAレベルを上記の方法で検討した。コントロールとして同様の方法で検出したβアクチンのmRNAレベルを使用し、デンシトメーターによる前者の検出値を後者の検出値で補正したところ、0分から45分まで5-Lipoxygenase mRNA発現レベルは一方的に増加していることが判明した。さらに好塩基球に特異的な反応性をみるために抗ヒトIgE抗体を用いた刺激を行い、同様の検討を行ったところ、20〜45分にかけて5-Lipoxygenase mRNAレベルが増大することが観察された。このことより、アトピー型気管支喘息において、アレルゲン吸入後にIgEを介した反応がおこり、アラキドン酸よりロイコトリエンC_4,D_4,E_4が作られる過程で、その合成過程に重要な5-Lipoxygenase mRNAの発現増加が示唆され、喘息患者では白血球5-Lipoxygenase mRNAの量的異常がおこっているものと思われた。

The first step was to investigate the semi-quantitative conditions for the expression of 5-Lipoxygenase mRNA in purified white blood cells by PCR. 5-Lipoxygenase cDNA Sequence: Whole blood samples were purified by MicroTrack mRNA purification kit, which was used to extract mRNA and reverse engineer cDNA. The temperature of PCR was 30 ℃ and the temperature was 54℃. The temperature of the PCR increases rapidly, and the temperature of the PCR increases rapidly. The above results show that PCR activity at 54℃ and mRNA expression of 5-Lipoxygenase is semi-quantitative. In addition, the purification of white blood cells is discussed in the following ways: The same method was used to detect the expression of β-lipoxygenase mRNA. The value of β-Lipoxygenase mRNA was corrected by 0 minutes and the value of 5-Lipoxygenase mRNA was corrected by 45 minutes. In addition, the expression of 5-Lipoxygenase mRNA was increased in 20 ~ 45 minutes after stimulation with anti-IgE antibodies. The increase of 5-Lipoxygenase mRNA expression in leukocytes of asthmatic patients is an important part of the synthesis of C_4, D_4 and E_4.