抗酸菌感染症における定量的PCRを応用した迅速診断法の開発

开发利用定量PCR快速诊断分枝杆菌感染的方法

• 批准号: 06670609
• 负责人: 久世 文幸
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06670609/
• 关键词: M.avium complex; polymerase chain reaction; alpha antigen; competitive PCR

PCR法を用いて排出抗酸菌の迅速な定量法を一部開発し、その検討を行なった。M.aviumのα抗原をコードしている遺伝子の中で、M.aviumに特異的な遺伝子配列を選択し、同部分を増幅するprimerの設計を行ない、これを現有のDNA合成装置を用いて作成した。また、当研究室にて臨床検体より分離保存している多数のM.avium complexを含む抗酸菌より、ガラスビーズ、ライソゾームにより溶菌し、フェノールを用いてDNAを抽出した。これをtemplateとして、先に作成したprimerを用いてサーマルサイクラ-によりPCRを行なった。PCR産物をアガロースゲル電気泳動し、更にサザンブロッティングを行ない、その有無を検出した。電気泳動では、M.aviumとM.mariumの両者でPCR陽性となったが、サザンブロッティングでは、M.aviumにのみ陽性であった。先に我々が設計したprimerと同じprimerで増幅され、かつ、更にそのPCR産物の長さが元のものと異なる遺伝子配列を持つcompetitorを、市販のcompetitor作成キットを用いて作成した。段階的に希釈したcompetitorをそれぞれ検体と共にPCRを行ない、反応液をアガロースゲルで電気泳動することにより検体由来の産物とcompetitor由来のものとを分離し、両者がほぼ同量となる箇所をもって検体中のM.avium complex由来のDNA量を判定した。この方法を菌液に対して同様に行なうことにより、菌の半定量化を試みた。実験の結果、菌由来のDNAでは、competitive PCRを行なうことにより、半定量が可能となった。また、培養菌液を用いた検討では、同様にcompetitive PCRを行なうことにより、菌量が多量の場合、半定量が可能となった。今後は、更にPCRの感度の向上をはかり、より少量の菌数での半定量化の開発が重要と思われた。なお、この研究成果の一部は、第65回実験結核研究会で発表予定である。

PCR was used as a rapid quantitative method for the elimination of acid-resistant bacteria. M.avium alpha antigen in the middle of the gene, M.avium specific gene alignment selection, the same part of the primer design, and the use of existing DNA synthesis equipment to create Most of the M.avium complexes were isolated and preserved in the laboratory, and DNA was extracted from the bacteria. The template is used to create the primer. PCR products were detected in the presence or absence of DNA. The positive reaction of M.avium and M.marium was detected by PCR. The positive reaction of M.avium was detected by PCR. First, we designed the primer and primer to increase the amplitude of the PCR product. Then we designed the primer and primer to increase the length of the PCR product. Then we designed the primer and primer to increase the amplitude of the PCR product. The amount of DNA in the sample was determined by PCR and reverse osmosis. This method is based on the semi-quantitative analysis of bacteria. Results, DNA origin, competitive PCR, semi-quantitative PCR For example, if the culture medium is used, the same competitive PCR may be performed, and the amount of bacteria may be increased. In the future, it will be important to develop semi-quantitative PCR sensitivity with a small number of bacteria. The 65th chapter of the Nodules Research Association was published in the first part of this paper.

项目成果

Katsuhiro Suzuki.et al: "Recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF)or tumour necrosis factor-alpha(TNF-α)macrophages to inhibit growth of Mycobacterium avium complex" Clinical and Experimental Immunology. 98. 169-173 (1994)

Katsuhiro Suzuki.et al：“重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 或肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 巨噬细胞抑制鸟分枝杆菌复合体的生长”临床和实验免疫学 98. 169-173。 (1994)