肢芽の未分化間充織細胞が合成するプロテオグリカン、PG-Mの構造と機能の解析

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1. プロテオグリカン、PG-Mは軟骨組織の形成に先立ち、間充織凝集部位で特異的かつ一過性に発現する成分である。こうしたPG-Mの特異的な発現を制御する機構を明らかにする目的で、PG-Mのコア蛋白質をコードするゲノムDNAの解析を進めている。これまでにPG-Mの遺伝子として100kbに渡る領域を解析し、すべてのエクソンを同定した。更に転写開始点とポリA付加位置を解析し、その結果PG-Mの転写産物に見られる多様性は、選択的スプライシングによる多様性に加え、ポリA付加位置の違いによって生じていることが明らかになった。またプロモーター領域を解析する目的で転写開始点より10kb上流までをコードするゲノムDNAをクローニングし、一部塩基配列を決定した。その結果転写開始点より28bp上流にTATAボックスが確認され、更に上流に種々の転写制御因子が結合する可能性のある塩基配列が認められた。そして線維芽細胞を用いたCATアッセイの結果、転写開始点より上流200から400bp付近に強いプロモーター活性が認められた。現在更に、軟骨細胞の分化過程で働くプロモーター領域を同定する目的で、未分化間充織細胞に似た性質を示しインシュリンによって軟骨細胞に分化するマウスのテラトカルシノーマ由来の細胞株(ATDC-5)を用いてプロモーター解析を進めている。2. PG-Mが持つ生理的機能を明らかにする目的で、相同組換えによりPG-M遺伝子を破壊したマウスの作成を進めている。ES細胞にターゲッティングベクターを導入し、PG-M遺伝子に変異を起こしたES細胞を4クローン分離した。そのうちの1つのクローンについてキメラマウスの作成を試みたがキメラ個体の生殖細胞に変異が検出されず、現在残りの3つのクローンについて更にキメラマウスの作成を進めている段階である。