組織特異的遺伝子トラップ法の確立と、その応用に向けた研究

组织特异性基因捕获方法的建立及其应用研究

• 批准号: 13878141
• 负责人: 篠村 多摩之
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Tokyo Medical and Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13878141/
• 关键词: 組織特異的; 遺伝子発現; 遺伝子トラップ法

本研究では独自に開発した遺伝子トラップ法を用い、マウスの未分化幹細胞(ATDC5細胞)が軟骨細胞に分化する過程で新たに活性化する遺伝子を、効率よく単離するための研究を進めてきた。既に予備轍の段階で軟骨組織特異的な遺伝子のいくつかを取り出すことに成功しているが、必ずしも全てのトラップされた遺伝子が軟骨特異的あるわけでない。そこで本研究を通し、擬陽性の遺伝子がトラップされる原因を明らかにし、その上でより高い確率で特異的遺伝子が単離可能な実験条牛の改善を進めた。その結果、ガンシクロピアによる負の選択が、本遺伝子トラップ法の特異性を決める最大の要因であるらしいことが明らかになってきた。そこでガンシクロピアによる負の選択条件について再検討を行い、薬剤濃度と処理時間の至適化を進めた。その結果、ガンシクロピアの濃度は15μMが最も効果的で、処理期間は10日間で充分であることが明らかになった。更に薬剤処理期間中、薬剤に対する細胞の応答性について注意深く観察した結果、ガンシクロビア耐性コロニーはそれぞれ増殖性に大きな差があることが明らかになった。ところで元々のATDC5細胞は15μMのガンシクロピア存在下でも高い増殖性を示すことから、遺伝子トラップ陽性の細胞としては、ガンシクロピア存在下で高い増殖性を示すコロニーを最適候補として選び、それらを解析対象とした。こうした選択法の改善により、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼと単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼの融合遺伝子が、ほぼ完全に不活性な状態にある未分化状態の細胞のみを解析対象とすることができると考えられる。現在こうした2段階選択方式によってトラップされた遺伝子について、その発現の特異性を調べているところである。

The present study is an independent effort to develop a novel method for the identification and differentiation of chondrocytes from undifferentiated stem cells (ATDC-5 cells). In order to prepare the cartilage tissue-specific gene, we need to extract the cartilage tissue-specific gene. This study is aimed at clarifying the reasons for the high accuracy of pseudo-positive genes and improving their potential. The result of the study is that the most important factor in determining the specificity of the method is the negative selection of the method. In addition, the selection conditions of the solvent and the treatment time are optimized. The results showed that the concentration of the drug was 15μM, and the treatment period was 10 days. In addition, during the treatment period, the response of the cells was carefully observed, and the results were analyzed. The ATDC5 cells showed high fertility in the presence of 15μM of protein, and the cells with high fertility in the presence of protein showed high fertility in the presence of protein. With the improvement of this selection method, it will be possible to analyze the core of cells in an undifferentiated state from a completely inactive state by using the fusion gene of the HIGROMAISHINESHITRINA and the single-cell selection process. Now, the 2-stage selection method is to adjust the specificity of the occurrence of the disease.