組織特異的遺伝子トラップ法の確立と、その応用に向けた研究

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本研究では独自に開発した遺伝子トラップ法を用い、マウスの未分化幹細胞(ATDC5細胞)が軟骨細胞に分化する過程で新たに活性化する遺伝子を、効率よく単離するための研究を進めてきた。既に予備轍の段階で軟骨組織特異的な遺伝子のいくつかを取り出すことに成功しているが、必ずしも全てのトラップされた遺伝子が軟骨特異的あるわけでない。そこで本研究を通し、擬陽性の遺伝子がトラップされる原因を明らかにし、その上でより高い確率で特異的遺伝子が単離可能な実験条牛の改善を進めた。その結果、ガンシクロピアによる負の選択が、本遺伝子トラップ法の特異性を決める最大の要因であるらしいことが明らかになってきた。そこでガンシクロピアによる負の選択条件について再検討を行い、薬剤濃度と処理時間の至適化を進めた。その結果、ガンシクロピアの濃度は15μMが最も効果的で、処理期間は10日間で充分であることが明らかになった。更に薬剤処理期間中、薬剤に対する細胞の応答性について注意深く観察した結果、ガンシクロビア耐性コロニーはそれぞれ増殖性に大きな差があることが明らかになった。ところで元々のATDC5細胞は15μMのガンシクロピア存在下でも高い増殖性を示すことから、遺伝子トラップ陽性の細胞としては、ガンシクロピア存在下で高い増殖性を示すコロニーを最適候補として選び、それらを解析対象とした。こうした選択法の改善により、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼと単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼの融合遺伝子が、ほぼ完全に不活性な状態にある未分化状態の細胞のみを解析対象とすることができると考えられる。現在こうした2段階選択方式によってトラップされた遺伝子について、その発現の特異性を調べているところである。