ATP合成酵素をモデルとする蛋白質分子の集合と機能発現に必須な構造の解明

使用 ATP 合酶作为模型阐明蛋白质分子组装和功能表达所必需的结构

• 批准号: 06680616
• 负责人: 金澤 浩
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06680616/
• 关键词: ATP合成酵素; モノクローナル抗体結合部位; 活性調節; αサブユニット

生体内エネルギーとして必須なATPを合成するATP合成酵素をモデルとして複数サブユニットからなる酵素の機能発現と構造形成の機構を明らかにする目的で、以下の3つのアプローチを行い、新しい知見を得ることができた。これらの成果は5編の国際誌に論文として発表し、高い評価を得ることもできた。(1)ATP合成酵素の機能欠損変異株からの機能回復もどり変異の解析:触媒部位を有するβサブユニットの174残基がセリンからフェニールアラニンに変異すると機能が失われる。この失われた変異の機能を回復させる第2の変異を解析したところ、295残基のアラニンがプロリンに変化する事が見いだされた。この第2変異単独でも機能が失われる。今回この295がプロリンに変異したものから、機能戻り変異を分離し解析したところ140,159,166,171,172残基に第二変異が認められた。これらの事実は、174残基近傍と295残基近傍の酵素機能発現における構造的機能的連携が存在することを示唆している(発表論文;BBA,(1994)、1187,p67-72)。(2)モノクローナル抗体をもちいた一次構造と立体構造の相関解明;αとβサブユニットに対するモノクローナル抗体を分離した。これらの抗体のエピトープとなる残基を新しい方法を開発して、決定できた。βのアミノ端41から45残基目付近を認識する2種の抗体は、本酵素の試験管内分子集合を阻害する。またエピトープ残基の変異により酵素分子集合が異常になる。この変異の戻り変異も併せて解析しこのアミノ端側と機能的に近傍するβ218残基およびα111残基を同定した(発表論文;JBC,(1994)269,4227-4232,FEBS Lett.,(1994)344,187-190,ABB,(1994)312,317-325)。また、αサブユニットに対する抗体2種について、ATPase活性を上昇させることが明らかとなった。このエピトープ残基はこのサブユニットのカルボキシ末端に位置する。このエピトープ残基のうち456番目のロイシンがプロリンになった場合、抗体が存在しなくても活性の上昇が認められた。この残基を含むアルファヘリックスの重要性が指摘された(発表論文;ABB,(1995)印刷中)。(3)試験管内再構成系を用いた解析:試験管内でαβγサブユニットを混ぜATPase活性を再構成させる系を用いて、この系にαおよびβサブユニットの部分ベプチドを導入し、分子集合を阻害する断片を同定した。この結果ベータの中央部分に分子集合に必須な部分が存在することを突き止めた。以上の知見は、ATP合成酵素の分子集合と機能発現に必須な構造を明らかにするのみではなく、新たに開発したこれらの方法自体が、他の高次構造を有する酵素の構造と機能の相関解明に役立つものと考えられる。

ATP synthase, which is essential for ATP synthesis in vivo, is a complex enzyme that functions and structures to form a mechanism for understanding and understanding the following three aspects of ATP synthesis. The results of this study were published in five parts of the International Journal. (1)ATP synthase function loss variant strain change function recovery change analysis: catalytic site has β-amino acid residue 174 change function loss. The function of the missing residue was recovered. The analysis of the second residue was carried out. The second difference is that the function is lost. The 295 residues were isolated from the 140, 159, 166, 171, and 172 residues. The functional linkage between enzyme function near residue 174 and enzyme function near residue 295 is shown in this paper (BBA,(1994), 1187,p67-72). (2)The primary structure and three-dimensional structure of the antibody are related to each other. A new method for the development and determination of antibodies Two kinds of antibodies were found to inhibit the molecular assembly of this enzyme in the test tube. The enzyme molecule set is abnormal. The identity of β218 residue and α111 residue in the vicinity of the functional end of the protein was determined by the analysis of the difference between the two residues. JBC,(1994) 269, 4227 -4232,FEBS Lett., (1994)344,187-190,ABB,(1994)312,317-325)。2 kinds of antibodies, ATPase activity increased The position of the residue at the end of the chain In the case of the presence of these residues, the activity of the antibody increases. The importance of this residue in determining the presence of a protein in a protein has been criticized (paper presented;ABB,(1995) in press). (3)Analysis of the recombination system in the test tube: the recombination system of αβγ δThe central part of the molecule must be present. The above findings indicate that ATP synthase molecular assembly and function must be constructed in order to understand the structure and function of ATP synthase.

项目成果

Junji Miki,Sadamu Tsugumi,and Hiroshi Kanazawa: "Reversion Mutations in the β subunit Mutants of Escherichia coli F_1-ATPase with Defective Subunit Assembly:Implications for Structure and Function of the Amino-Terminal Region" ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND

Junji Miki、Sadamu Tsugumi 和 Hiroshi Kanazawa：“具有缺陷亚基组装的大肠杆菌 F_1-ATP 酶 β 亚基突变体中的回复突变：对氨基末端区域的结构和功能的影响”生物化学和生物化学档案

Junji Miki,Yoshihisa Ishihara,Takashi Mano,Takato Noumi,Hiroshi Kanazawa: "Residues interacting with serine-174 and alamine-295 in the β-subunit of Escherichia coli H^+-ATP synthase:possible ternary structure of the center region of the subunit" Biochimic

Junji Miki、Yoshihisa Ishihara、Takashi Mano、Takato Noumi、Hiroshi Kanazawa：“与大肠杆菌 H^+-ATP 合酶 β 亚基中的丝氨酸 174 和阿拉胺 295 相互作用的残基：中心区域的可能三元结构“亚基”生物化学

Junji Miki,Hirofumi Kusuki,Sadamu Tsugumi,and Hiroshi Kanazawa: "Amino Acid Replacements at Binding Sites of Monoclonal Antibody in the F_1-ATPase β subunit from Escherichia coli Caused Altered Subunit Interactions^*" THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY.

Junji Miki、Hirofumi Kusuki、Sadamu Tsugumi 和 Hiroshi Kanazawa：“大肠杆菌 F_1-ATPase β 亚基中单克隆抗体结合位点的氨基酸替换导致亚基相互作用改变^*”生物化学杂志。

Junji Miki^<**>,Sadamu Tsugumi,Hiromi Ikeda,Hiroshi Kanazawa^*: "Intergenic suppresion in a β subunit mutant with defective assembly in Escherichia coli F_1ATPase Second-site mutation in the α subunit" FEBS Letters. 344. 187-190 (1994)

Junji Miki^<**>、Sadamu Tsugumi、Hiromi Ikeda、Hiroshi Kanazawa^*：“大肠杆菌 F_1ATPase α 亚基中组装缺陷的 β 亚基突变体的基因间抑制” FEBS Letters 344。187- 190 (1994)

Hiroshi Kanazawa,^1Munehisa Yabuki,Junji Miki,Toshiaki Fudemoto,Hiromi Ikeda,Takato Noumi,and Yongchol Shin: "Enhancement of Escherichia coliH^+-ATPase Caused by Binding og Monoclonal Antibodies Is Attributed to Structural Changes of Leu-456 and Ser-440 i

Hiroshi Kanazawa、^1Munehisa Yabuki、Junji Miki、Toshiaki Fudemoto、Hiromi Ikeda、Takato Noumi 和 Yongchol Shin：“结合单克隆抗体引起的大肠杆菌 H^ -ATP 酶增强归因于 Leu-456 和 Ser-440 的结构变化