ATP合成酵素をモデルとする蛋白質分子の集合と機能発現に必須な構造の解明

使用 ATP 合酶作为模型阐明蛋白质分子组装和功能表达所必需的结构

• 批准号: 06680616
• 负责人: 金澤 浩
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06680616/
• 关键词: ATP合成酵素; モノクローナル抗体結合部位; 活性調節; αサブユニット

生体内エネルギーとして必須なATPを合成するATP合成酵素をモデルとして複数サブユニットからなる酵素の機能発現と構造形成の機構を明らかにする目的で、以下の3つのアプローチを行い、新しい知見を得ることができた。これらの成果は5編の国際誌に論文として発表し、高い評価を得ることもできた。(1)ATP合成酵素の機能欠損変異株からの機能回復もどり変異の解析:触媒部位を有するβサブユニットの174残基がセリンからフェニールアラニンに変異すると機能が失われる。この失われた変異の機能を回復させる第2の変異を解析したところ、295残基のアラニンがプロリンに変化する事が見いだされた。この第2変異単独でも機能が失われる。今回この295がプロリンに変異したものから、機能戻り変異を分離し解析したところ140,159,166,171,172残基に第二変異が認められた。これらの事実は、174残基近傍と295残基近傍の酵素機能発現における構造的機能的連携が存在することを示唆している(発表論文;BBA,(1994)、1187,p67-72)。(2)モノクローナル抗体をもちいた一次構造と立体構造の相関解明;αとβサブユニットに対するモノクローナル抗体を分離した。これらの抗体のエピトープとなる残基を新しい方法を開発して、決定できた。βのアミノ端41から45残基目付近を認識する2種の抗体は、本酵素の試験管内分子集合を阻害する。またエピトープ残基の変異により酵素分子集合が異常になる。この変異の戻り変異も併せて解析しこのアミノ端側と機能的に近傍するβ218残基およびα111残基を同定した(発表論文;JBC,(1994)269,4227-4232,FEBS Lett.,(1994)344,187-190,ABB,(1994)312,317-325)。また、αサブユニットに対する抗体2種について、ATPase活性を上昇させることが明らかとなった。このエピトープ残基はこのサブユニットのカルボキシ末端に位置する。このエピトープ残基のうち456番目のロイシンがプロリンになった場合、抗体が存在しなくても活性の上昇が認められた。この残基を含むアルファヘリックスの重要性が指摘された(発表論文;ABB,(1995)印刷中)。(3)試験管内再構成系を用いた解析:試験管内でαβγサブユニットを混ぜATPase活性を再構成させる系を用いて、この系にαおよびβサブユニットの部分ベプチドを導入し、分子集合を阻害する断片を同定した。この結果ベータの中央部分に分子集合に必須な部分が存在することを突き止めた。以上の知見は、ATP合成酵素の分子集合と機能発現に必須な構造を明らかにするのみではなく、新たに開発したこれらの方法自体が、他の高次構造を有する酵素の構造と機能の相関解明に役立つものと考えられる。

It is necessary to synthesize ATP in vivo, and it is necessary to synthesize ATP synthesis enzyme and enzyme enzyme machine. The mechanism that can realize the structure formation is the purpose of the structure.これらの Results は 5th edition の国志にpaper として発表し, 高いreview価を得ることもできた. (1)Analysis of the functional recovery of the ATP synthase enzyme deficiency: the catalyst part is there β-サブユニットの174 residues are the same as the original one.この无われた変differentの FunctionをReplyさせるThe 2nd の変differentをANALYSISしたところ, 295 residues of のアラニンがプロリンに変化する事が见いだされた.このThe second difference is that the function is lost. This time 295がプロリンに変differentしたものから、FUNCTIONAL 戻り変differentをSeparationしたThe second difference between residues 140, 159, 166, 171, and 172 is the same. The enzyme function of the 174-residue neighbor and the 295-residue neighbor enzyme function is linked to the functional structure of the これらの事実は. Existence することを Shows Instigation している (発 table paper; BBA, (1994), 1187, p67-72). (2) Correlation solution of the primary structure and three-dimensional structure of the monoclonal antibody Ming; α and β サブユニットに対するモノクローナルantibody isolation and した.これらのAntibodyのエピトープとなるResidueを新しいmethodを开発して、Decisionできた. The 41 and 45 residues at the end of the beta molecule are close to each other and two kinds of antibodies are known. This enzyme can block the assembly of molecules in the test tube. The set of またエピトープ residues and different により enzyme molecules is abnormal.この変 Different の戻り変different も与せてanalytic しこのアミノEnd-side と function に near するβ218 residue およびα1 11Residues are identical (Table of Papers; JBC, (1994) 269, 4227-4232, FEBS Lett., (1994) 344, 187-190, ABB, (1994) 312, 317-325).また, αサブユニットに対する antibody 2 kinds of について, ATPase activity をrise させることが明らかとなった. The このエピトープ residue is the はこのサブユニットのカルボキシ terminal に position.このエピトープ灮うち456号のロイシンがプロリンにIn such cases, the presence of antibodies and the increase in their activity are recognized by the presence of antibodies. The importance of the residue residues contained in the residues is determined by the importance of the residue (Hibiao paper; ABB, (1995) in press). (3) Analysis of the reconstruction system in the test tube: the ATPase activity in the test tube is reconstituted by mixing αβγ System を use いて, この system にαおよびβサブユニットのpart ベプチドを introduction し, molecular set を hinder する fragment を same determination した. The result is that the central part of the molecule must be collected and the part must exist. The above knowledge, the molecular assembly of ATP synthase and the necessary structure for the realization of its functions are as follows:発したこれらの法自体が、His higher-order structure を有するEnzyme のstructure and function のrelated explanations に伫立つものと考えられる.

项目成果

Junji Miki,Sadamu Tsugumi,and Hiroshi Kanazawa: "Reversion Mutations in the β subunit Mutants of Escherichia coli F_1-ATPase with Defective Subunit Assembly:Implications for Structure and Function of the Amino-Terminal Region" ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND

Junji Miki、Sadamu Tsugumi 和 Hiroshi Kanazawa：“具有缺陷亚基组装的大肠杆菌 F_1-ATP 酶 β 亚基突变体中的回复突变：对氨基末端区域的结构和功能的影响”生物化学和生物化学档案

Junji Miki,Yoshihisa Ishihara,Takashi Mano,Takato Noumi,Hiroshi Kanazawa: "Residues interacting with serine-174 and alamine-295 in the β-subunit of Escherichia coli H^+-ATP synthase:possible ternary structure of the center region of the subunit" Biochimic

Junji Miki、Yoshihisa Ishihara、Takashi Mano、Takato Noumi、Hiroshi Kanazawa：“与大肠杆菌 H^+-ATP 合酶 β 亚基中的丝氨酸 174 和阿拉胺 295 相互作用的残基：中心区域的可能三元结构“亚基”生物化学

Junji Miki,Hirofumi Kusuki,Sadamu Tsugumi,and Hiroshi Kanazawa: "Amino Acid Replacements at Binding Sites of Monoclonal Antibody in the F_1-ATPase β subunit from Escherichia coli Caused Altered Subunit Interactions^*" THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY.

Junji Miki、Hirofumi Kusuki、Sadamu Tsugumi 和 Hiroshi Kanazawa：“大肠杆菌 F_1-ATPase β 亚基中单克隆抗体结合位点的氨基酸替换导致亚基相互作用改变^*”生物化学杂志。

Junji Miki^<**>,Sadamu Tsugumi,Hiromi Ikeda,Hiroshi Kanazawa^*: "Intergenic suppresion in a β subunit mutant with defective assembly in Escherichia coli F_1ATPase Second-site mutation in the α subunit" FEBS Letters. 344. 187-190 (1994)

Junji Miki^<**>、Sadamu Tsugumi、Hiromi Ikeda、Hiroshi Kanazawa^*：“大肠杆菌 F_1ATPase α 亚基中组装缺陷的 β 亚基突变体的基因间抑制” FEBS Letters 344。187- 190 (1994)

Hiroshi Kanazawa,^1Munehisa Yabuki,Junji Miki,Toshiaki Fudemoto,Hiromi Ikeda,Takato Noumi,and Yongchol Shin: "Enhancement of Escherichia coliH^+-ATPase Caused by Binding og Monoclonal Antibodies Is Attributed to Structural Changes of Leu-456 and Ser-440 i

Hiroshi Kanazawa、^1Munehisa Yabuki、Junji Miki、Toshiaki Fudemoto、Hiromi Ikeda、Takato Noumi 和 Yongchol Shin：“结合单克隆抗体引起的大肠杆菌 H^ -ATP 酶增强归因于 Leu-456 和 Ser-440 的结构变化