Na^+/H^+イオン逆輸送担体の構造・機能・制御の協関と生物種間における多様性

Na^+/H^+离子反向传输载体的结构、功能和调控方面的合作以及物种间的多样性

• 批准号: 09257230
• 负责人: 金澤 浩
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09257230/
• 关键词: pH調節; Na^+; H^+交換輸送; 遺伝子クローン化; 生物学的多様性

本年度の研究目標は以下の3点であった。(1)主として下等真核生物のNa^+/H^+遺伝子をクローン化しその構造比較より本輸送蛋白質の構造・機能・制御の多様性を考察する。(2)大腸菌のNhaA交換輸送担体の構造・機能協関を解析する。(3)ラットのNa^+/H^+交換輸送担体NHE1および3の細胞質ドメインに結合する因子を解析する。これらの目標に対して(1)酵母の仲間であるHanselula. anomala,Aspergillus. nidulans,Candida. tolopicalisのNha型の遺伝子を新規にクローン化できた。とくに、H.anomalaではその全長の塩基配列を決定したところ、膜貫通領域はSaccharomyces cerevisiaeやZygosaccharomyces rouxieeと70%近い相同性が認められたが、細胞質領域は20%程度の低い相同性があるのみであることが明らかになり、制御の多様性の存在が推察される。また、一部に保存された部分が認められ、この部分の機能的重要性が指摘された。(2)PhoAとNhaAとの融合蛋白質を作製し、NhaAの細胞膜内配向性を決定したところ、膜貫通構造の中に十分な膜貫通に必要な残基数を有さない部分が指摘できた。この部分はこのイオン輸送蛋白質のpH依存の活性発現と関係する部分であることが明らかになった。(3)として、NHE変換輸送担体の細胞質領域と結合する2種の新規蛋白質遺伝子をクローン化していたが、このうち1種は大腸菌において過剰発現後精製し、抗体を調製した。この抗体を用いた解析から、本蛋白質は免疫組織染色から乳腺や胃腺の分泌管上皮に多く発現しており、イオン交換輸送体の発現部位と一致した。また、上皮系培養細胞でも高発現していることが明らかとなり、今後の解析に有用な手段となることがわかった。

This year's research objectives are as follows: (1)Structure comparison of Na^+/H^+ gene in eukaryotes and investigation of structure, function and regulatory diversity of this protein (2)Analysis of the structure-function relationship of NhaA exchange carriers in Escherichia coli. (3)Analysis of Na^+/H^+ exchange transport vectors NHE1 and NHE 3 for cytoplasmic binding factors (1) Hanselula. anomala,Aspergillus. nidulans,Candida. Tolopicalis Nha type genetic code new rules H.anomala is the only one with a total length of 70% identity in the membrane-penetrating domain. It is also the only one with a low identity of 20% in the cytoplasmic domain. The importance of the preservation of this part is recognized. (2)PhoA and NhaA fusion protein production, NhaA cell membrane alignment, membrane penetration structure, membrane penetration necessary residue number, part of the analysis. The pH-dependent activity of protein transport in these parts is related to the activity of protein transport. (3)Two new protein genes were synthesized in the cytoplasmic domain of the NHE transporter, one was purified after the development of E. coli, and the other was prepared for antibody. This protein was found in the secretory epithelium of mammary gland and gastric gland by immunohistochemical staining. Epithelial-line culture cells are highly developed and useful for future analysis.

项目成果

Sawada,K.: "Subunit interactions of Esherichia coli F_1-ATPase : Mutants of the γ subunits defective in interaction with the ε subunit isolated by the yeast two-hybrid system" Arch.Biochem.Biophys.Vol.348. 183-189 (1997)

Sawada, K.：“大肠杆菌 F_1-ATP 酶的亚基相互作用：与酵母双杂交系统分离的 ε 亚基相互作用缺陷的 γ 亚基突变体”Arch.Biochem.Biophys.Vol.348（ 1997)

Shin,Y.: "Escherichia coli F_1-ATPase subunit interactions : β and γ subunit peptides inhibit in vitro reconstitution of the active αβγ complex" Arch.Biochem.Biophys.Vol.340. 36-42 (1997)

Shin, Y.：“大肠杆菌 F_1-ATP 酶亚基相互作用：β 和 γ 亚基肽抑制活性 αβγ 复合物的体外重建”Arch.Biochem.Biophys.Vol.36-42 (1997)。

Sawada,K.: "Interaction of the δ and b Subunits Contributes to F_1 and F_0 Interaction in the Escherichia coli F_1F_0-ATPase" J.Biol.Chem.Vol.272. 30047-30053 (1997)

Sawada, K.：“δ 和 b 亚基的相互作用有助于大肠杆菌 F_1F_0-ATP 酶中的 F_1 和 F_0 相互作用”J.Biol.Chem.Vol.272 (1997)。

Yabuki,M.: "Catalytic and structural importance of residues Gly-454,Try-455 and Leu-456 in the carboxy-terminal region of Escherichia coli F_1-ATPase α subunit" Arch.Biochem.Biophys.Vol.338. 104-110 (1997)

Yabuki, M.：“大肠杆菌 F_1-ATPase α 亚基羧基末端区域中残基 Gly-454、Try-455 和 Leu-456 的催化和结构重要性”Arch.Biochem.Biophys.Vol.338-。 110 (1997)

Noumi,T.: "Identification and Characterization of Functional Residues in a Na^+/H^+ Antiporter(NhaA)from Escherichia coli by Randoin Mutagenesis" J.Biochem.Vol.121. 661-1670 (1997)

Noumi,T.：“通过 Randoin 诱变对大肠杆菌 Na^ /H^ 反转运蛋白 (NhaA) 中的功能残基进行鉴定和表征”J.Biochem.Vol.121。