Na^+/H^+イオン逆輸送担体の構造・機能・制御の協関と生物種間における多様性

Na^+/H^+离子反向传输载体的结构、功能和调控方面的合作以及物种间的多样性

基本信息

批准号：
09257230
负责人：
金澤浩
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09257230/
关键词：
pH調節 Na^+H^+交換輸送遺伝子クローン化生物学的多様性

项目摘要

本年度の研究目標は以下の3点であった。(1)主として下等真核生物のNa^+/H^+遺伝子をクローン化しその構造比較より本輸送蛋白質の構造・機能・制御の多様性を考察する。(2)大腸菌のNhaA交換輸送担体の構造・機能協関を解析する。(3)ラットのNa^+/H^+交換輸送担体NHE1および3の細胞質ドメインに結合する因子を解析する。これらの目標に対して(1)酵母の仲間であるHanselula. anomala,Aspergillus. nidulans,Candida. tolopicalisのNha型の遺伝子を新規にクローン化できた。とくに、H.anomalaではその全長の塩基配列を決定したところ、膜貫通領域はSaccharomyces cerevisiaeやZygosaccharomyces rouxieeと70%近い相同性が認められたが、細胞質領域は20%程度の低い相同性があるのみであることが明らかになり、制御の多様性の存在が推察される。また、一部に保存された部分が認められ、この部分の機能的重要性が指摘された。(2)PhoAとNhaAとの融合蛋白質を作製し、NhaAの細胞膜内配向性を決定したところ、膜貫通構造の中に十分な膜貫通に必要な残基数を有さない部分が指摘できた。この部分はこのイオン輸送蛋白質のpH依存の活性発現と関係する部分であることが明らかになった。(3)として、NHE変換輸送担体の細胞質領域と結合する2種の新規蛋白質遺伝子をクローン化していたが、このうち1種は大腸菌において過剰発現後精製し、抗体を調製した。この抗体を用いた解析から、本蛋白質は免疫組織染色から乳腺や胃腺の分泌管上皮に多く発現しており、イオン交換輸送体の発現部位と一致した。また、上皮系培養細胞でも高発現していることが明らかとなり、今後の解析に有用な手段となることがわかった。

今年的研究目标如下：（1）我们将克隆Na^+/H^+基因，主要来自较低的真核生物，并通过比较其结构来检查该转运蛋白的结构，功能和调节的多样性。（2）分析大肠杆菌中NHAA交换运输载体的结构和功能合作。（3）分析与大鼠Na^+/H^+交换运输载体NHE1和3的胞质结构域结合的因子。对于这些目标，（1）我们能够从Hanselula获得新的克隆NHA型基因。 Anomala，曲霉。 Nidulans和Candida。 Tolopicalis，是酵母菌。特别是，当在H. anomala中确定全长核苷酸序列时，发现跨膜区域与酿酒酵母和Zygosacachomyces rouxiee具有近70％的同源性，但发现细胞质区域只有低约20％的人的生物学，并且具有较低的人物性，并且存在于20％的不同之中，并且有多种多样的变化。此外，保留了一些部分，并指出了这一部分的功能重要性。（2）当产生phoa和NHAA之间的融合蛋白时，确定了NHAA的膜内方向，可以指出，跨膜结构的一部分没有足够数量的跨膜残基。该部分已显示与该离子转运蛋白的pH相关活性表达有关。在（3）中，将两个新型蛋白质基因与NHE转换传输载体的细胞质区域结合结合，克隆了其中一个在大肠杆菌中过表达并纯化以制备抗体。使用该抗体的分析表明，该蛋白在免疫组织化学染色中高度表达在乳腺和胃腺的分泌导管上皮中，并且与离子交换转运蛋白的表达位点一致。还揭示了它在上皮培养的细胞中高度表达，并且发现它是将来分析的有用工具。