Na^+/H^+イオン逆輸送担体の構造・機能と制御の多様性と統一性

Na^+/H^+离子反向传输载体结构、功能和控制的多样性和统一性

• 批准号: 08268234
• 负责人: 金澤 浩
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08268234/
• 关键词: Na^+; H^+逆輸送系; イオン輸送の分子機構; Two-hybrid法による遺伝子クローン化; カルシュウム結合性タンパク質

本研究では細胞内におけるpH調節を含むイオン環境維持に極めて重要な役割を有し、生物界に広く存在するNa^+/H^+逆輸送担体蛋白質の構造と機能・制御の分子レベルでの理解を目指した。この輸送担体は特徴的な構造を有している。すなわち高等真核生物および原核生物を通じて10回内外の細胞膜貫通部分が存在する。一方高等真核生物では細胞膜ドメインに加えて細胞質に突出した部分が存在する。一次構造上は原核生物と真核生物で相同性はほとんどなく多様である。このような多様な構造がどのように機能と制御に関わっているのか、構造と機能の協関を明らかにする事が本研究の目的である。現在、次の3点に焦点をあてて研究を展開している。(1)大腸菌NhaA蛋白質の機能に必須な残基の同定:イオン輸送に関わる構造と機能の多様性と統一性を理解する第一歩として、細胞質ドメインを有さない、分子遺伝学的アプローチの簡単な大腸菌を材料として、Na+/H+逆輸送蛋白質NhaAの機能欠損変異株を分離し変異残基の同定、変異に伴う機能変換の解析から機能に必須な6残基を見いだした。特に133,163,164残基目のAspの重要性を見いだした。また、73と225残基目がH^+センサーとして機能する事を明らかにした。このほか7残基についても機能またはアセンブリーに重要であることを見いだした。この知見に基づきイオン輸送の経路となる残基の一旦を推定できた。現在この蛋白質の膜中でのトポロジーを解析中である。(2)ラットNHE1およびNHE3の細胞質ドメインに結合する蛋白質遺伝子のクローン化:ラットのNa^+/H^+逆輸送系のアイソフォームであるNHE1およびNHE3は細胞質に突出した部分を有し、細胞増殖シグナルによる活性発現制御を受けている。この制御機構を解明する一環としてこれらの逆輸送蛋白質の細胞質ドメインに結合する蛋白を蛋白質-蛋白質相互作用を指標に検索し、2種の蛋白質の存在を確認した。また酵母のTwo-hybrid法を用いて2種の新たな結合蛋白質の遺伝子のクローン化に成功し、CHP/No.18と名付けた。このうち1種は195残基からなる新規タンパク質であり、カルシニューリンBと高い相同性を有していた。現在これらの蛋白質の性質を解明するため、さらに一連の実験を行っている。(3)酵母(S.cerevisiae)の逆輸送蛋白質遺伝子の同定と機能解析:高等真核および原核生物の間に存在する下等真核生物のNa^+/H^+逆輸送蛋白質については遺伝子のクローン化が進んでおらず、多様性を理解する上で重要な対象と考えた。現在までにS.cerevisiaeの遺伝子を本年決定された全遺伝子塩基配列データバンクのなかから見出し、クローン化し構造を推定したところ、高等真核生物と同様細胞質ドメインを有しており、相同性は極めて低いことが見いだされた。すでにS.pombeでは細胞質を有さないNa^+/H^+逆輸送担体の存在があきらかだったので、進化上、酵母の近辺に細胞質を有するか否かの接点が存在すると考えられる。このような事実が制御の多様性と統一性にどのように関わっているのか明らかにするためには、さらに多くの下等真核生物の本逆輸送担体遺伝子のクローン化が必要であり、これを現在進めている。

This study provides insight into the structure and function of Na^+/H^+ reverse transport proteins in intracellular pH regulation, including environmental maintenance, and their existence in biology. The transport carrier has a characteristic structure. The cell membrane of higher eukaryotes and prokaryotes is connected by 10 loops. A higher eukaryote has more cytoplasmic protrusions than its cell membrane. A structure on the prokaryote and eukaryote identity The purpose of this study is to clarify the relationship between structure and function. Now, the next three points focus on the study. (1)Identification of residues essential for the function of Escherichia coli NhaA protein: first step in understanding the structural and functional diversity and uniformity of NhaA protein related to its transport; first step in understanding the structural and functional diversity and uniformity of NhaA protein related to its transport; first step in understanding the structural and functional diversity of NhaA protein related to its transport; second step in understanding the structural and functional diversity of NhaA protein related to its transport; third step in understanding the structural and functional diversity of NhaA protein related to its transport; third step in understanding the structural and functional diversity of NhaA protein related to its transport; fourth step in understanding the structural and functional diversity of NhaA protein related to its transport; third step in understanding the structural and functional diversity of NhaA protein related to its transport; fourth step in understanding the structural and functional diversity of NhaA protein related to its transport; third step in understanding the structural and functional diversity of NhaA protein related to its transport; and fourth step in understanding the structural and functional diversity of NhaA protein related to its transport. The importance of residues 133, 163, 164 and Asp is highlighted. Residues 73 and 225 are designated H^+ and H ^+. This is the most important part of the 7 residues. This knowledge allows us to estimate the identity of residues involved in the molecular transport pathway. Now the protein in the membrane is in the analysis. (2)The cytoplasmic binding of NHE1 and NHE3 protein proteins was studied. The Na^+/H^+ reverse transport system was studied. The cytoplasmic protrusion of NHE1 and NHE3 was detected. The activity of NHE1 and NHE3 was controlled by the cytogenetic system. This control mechanism was identified as a link between protein binding and cytoplasmic transport of proteins, and the presence of two proteins was identified as indicators of protein-protein interaction. The yeast Two-hybrid method was used to successfully convert two novel binding protein proteins into CHP/No.18. The 195 residues in the first species are different from those in the second species. The properties of these proteins are now understood in detail. (3)Identification and functional analysis of reverse transport protein in yeast (S.cerevisiae): Na^+/H^+ reverse transport protein in higher eukaryotes and lower eukaryotes is important for understanding the evolution and diversity of reverse transport protein. Now, S. cerevisia's genetic code has been determined this year, and the genetic code of S. cerevisia has been determined. The genetic code of S. cerevisia has been determined. The genetic code of S. cerevisia has been determined. The existence of Na^+/H^+ reverse transport vector in cytoplasm of S.pombe, evolution, cytoplasm of yeast and its vicinity. The diversity and unity of control are essential for the development of the reverse transport vector in lower eukaryotes.

项目成果

Moritani-Ohtsuka,C.: "Interactions of the F1-ATPase subunits from Escherichia coli detected by the yeast two-hybrid system" Biochem.Biophys.Acta. 1274. 67-72 (1996)

Moritani-Ohtsuka,C.：“酵母双杂交系统检测到的大肠杆菌 F1-ATP 酶亚基的相互作用”Biochem.Biophys.Acta。

Shin,Y.: "Reconstitution of the F1-ATPase activity from purified α,β,γ,and δ or ε subunit with glutathione S-transferase fused at their amino termini" Biochem.Biophys.Acta. 1273. 62-70 (1996)

Shin, Y.：“用在氨基末端融合的谷胱甘肽 S-转移酶重建纯化的 α、β、γ 和 δ 或 ε 亚基的 F1-ATP 酶活性”Biochem.Biophys.Acta.1273. 62-70 (1996) ）

Shin,Y.: "Escherichia coli F1-ATPase subunit interactions : β and γ subunit peptides inhibit in witro reconsitution of the active αβγ complex" Arch.Biochem.Biophys.(印刷中).

Shin, Y.：“大肠杆菌 F1-ATP 酶亚基相互作用：β 和 γ 亚基肽抑制活性 αβγ 复合物的体外重建”Arch.Biochem.Biophys（出版中）。

Yabuki,M.: "Catalytic and atructural importance of Gly 454,Tyr-455 and Leu-456 in the carboxy-terminal region of Escherichia coli F1-ATPase α subunit" Arch.Biochem.Biophys.(印刷中).

Yabuki, M.：“Gly 454、Tyr-455 和 Leu-456 在大肠杆菌 F1-ATPase α 亚基的羧基末端区域的催化和结构重要性”Arch.Biochem.Biophys（出版中）。

Noumi,T.: "Identification and characterization of functional residues in Na^+/H^+ antiporter (NhaA) from Escherichia coli by random mutagenesis" J.Biochem.(印刷中).

Noumi, T.：“通过随机诱变对大肠杆菌 Na^+/H^+ 反向转运蛋白 (NhaA) 中的功能残基进行鉴定和表征”J.Biochem。