バキュロウイルスによる共有結合型フラビン酵素のアポタンパク質の産生とその再構成

杆状病毒生产共价黄酶脱辅基蛋白及其重组

• 批准号: 06680635
• 负责人: 錦見 盛光
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Institute of Applied Biochemistry
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06680635/
• 关键词: グロノラクトン酸化酵素; 共有結合型フラビン; アポタンパク質; バキュロウイルス; 高レベル発現; 部位特異的突然変異

高等真核生物における共有結合型フラビンの形成メカニズムを解明するため,ラットのグロノラクトン酸化酵素(GLO)のアポタンパク質をバキュロウイルスを用いて作るための細胞培養系の確立を試みた。まず,ラットGLOのcDNAをカイコ多核体病ウイルスへ組み込んで組換え体ウイルスを作製し,これをカイコ培養細胞BMN4へ感染させてGLOを発現させた。発現の確認は酵素活性の測定とウエスタンブロット法で行った。GLOを発現した細胞の抽出液は,ラット肝臓のミクロゾーム画分と同程度の比活性を示し、GLOの高レベルの発現を実現できた。また,FADが酵素タンパク質に共有結合していることを,SDS-ゲル電気泳動後にフラビンの蛍光を発するバンドを検出することによって証明した。次に,リボフラビン欠乏条件下で組換え体ウイルスを細胞に感染させると,発現されたGLOタンパク質の大部分がアポ型であることを,細胞抽出液へのFADの添加によって酵素活性が著明に増加することにより確認した。FADの添加によって得られた活性は,通常の培養条件で発現したGLOと等しかった。しかし,FADのアポタンパク質への共有結合は起きていなかったので,活性発現には共有結合は必要でないことが分かった。さらに,FADが結合すると予想されるヒスチジン残基を部位特異的突然変異によってセリン,システインないしチロシンに変えた変異型GLOをバキュロウイルスを用いて発現させると,細胞抽出液のGLO活性は正常のGLOを発現させたものに比べ低いが,これにFADを添加すると活性が回復した。この事実から,アミノ酸の置換によって共有結合が起きないために変異型GLOはアポタンパ質として生成されるものと考えられる。

The establishment of cell culture lines for the formation of consensus binding enzymes in higher eukaryotes was studied. GLO cDNA was detected in cultured BMN4 cells. Determination of enzyme activity by the method of identification The extract of GLO cells was found to be highly reactive and to the same extent specific to GLO. FAD is a common enzyme that binds to the enzyme and is capable of producing light after electromigration. In addition, the presence of FAD in cell extracts was confirmed to increase the activity of enzymes in cells infected with GLO protein in the absence of GLO protein. FAD was added to the culture medium and the activity was detected under normal culture conditions. FAD is the most common type of binding, and the most common type of binding is the most common type of binding. In addition,FAD binding is expected to cause site-specific changes in GLO activity, which is lower than normal GLO activity. This is the first time that the GLO has been used in the production of a variety of products.

项目成果

Morimitsu Nishikimi: "Production by a baculovirus expression system of the apoprotein of L-gulono-γ-lactone oxidase,a flavoenzyme possessing a covalently-bound FAD" Biochemistry and Molecular Biology International. 33. 313-320 (1994)

Morimitsu Nishikimi：“通过杆状病毒表达系统生产 L-古洛糖酸-γ-内酯氧化酶的脱辅基蛋白，这是一种具有共价结合的 FAD 的黄素酶”，《国际生物化学与分子生物学》33. 313-320 (1994)。