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活性持続型ビタミンCによる組織形成誘導機構の研究-ビタミンC応答配列の解析

长效维生素C诱导组织形成机制研究——维生素C反应元件分析

基本信息

批准号：
06680678
负责人：
畑隆一郎
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06680678/
关键词：
活性持続型ビタミンC 組織形成コラーゲン転写制御

项目摘要

活性持続型ビタミンC(Asc2-P)の組織形成誘導機構の解析過程に、Asc2-PはI型コラーゲンの合成を特異的に活性化し、かつ、de novoの蛋白質合成を必要としない遺伝子の転写レベルの活性化であることが明らかになった。そこで,Asc2-PによるI型コラーゲンのα1(I)鎖、およびα2(I)鎖遺伝子の転写活性化に関与する応答配列を解析した。それぞれの遺伝子の上流-500bpから第一エキソンの非翻訳領域(+120あるいは+138bpまで)をPCR法で増幅し、この領域をルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子とするベクターに挿入したコンストラクト、pGVBα1(I)(0.6k)、およびpGVBα2(I)(0.6k)を作製した。制限地図および塩基配列の決定により、目的の生成物であることを確認後、リポソーム(ジーントランスファー)を用いてヒト皮膚繊維芽細胞にトランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性が最大を示す条件を決定した。この条件でレポーター遺伝子をトランスフェクトした後、さらにAsc2-P存在下、あるいは非存在下で培養後、ルシフェラーゼ活性の発現を測定したが、Asc2-Pの添加に関係なく同じ活性を示したので、この領域には応答配列は存在しないと考えられた。ついで、さらに広い領域を調べるためにα1(I)鎖、α2(I)鎖遺伝子、およびそれぞれの上流領域を含むCharon4Aベクター(RMS8およびNJ13)のインサートをpB1uescriptIIを用いてサブクローニングし、遺伝子の上流から第一イントロンを含むレポーター遺伝子pGVBα1(I)(2.2k)およびpGVBα1(I)(4.0k)を作製し、上記と同様にトランスフェクトし、培養したが、Asc2-Pの添加の有無にかかわらず発現活性は低かった。これらのベクターのインサートにはコラーゲンα1(I)鎖あるいはα2(I)鎖の翻訳開始コドンを含むため、ルシフェラーゼ遺伝子の翻訳が阻害され、発現活性が低いと考えられた。現在、遺伝子の上流と第一イントロンの領域を別々に挿入したレポーター遺伝子を作製し応答配列を決定中である。

In the process of analyzing the tissue formation induction mechanism of active type C(Asc2-P), Asc2-P is necessary for the specific activation, synthesis and de novo protein synthesis of type I protein. Therefore, the response sequences related to the write activation of the α1(I) lock and α2(I) lock vectors of the Type I Koragen in Asc2-P are analyzed. PCR amplification was performed on the upstream-500bp of the gene and the non-inverted domain (+120bp) of the first sequence, and the domain was controlled by pGVBα1(I)(0.6k) and pGVBα2 (I)(0.6k). To determine the maximum activity of the target product after confirmation of the target gene sequence, the target gene sequence is determined by the maximum activity of the target gene sequence. Under these conditions, Asc2-P was added to the mixture, and the activity of Asc2-P was measured in the presence and absence of Asc2-P.ついで、さらに広い领域を调べるためにα1(I)锁、α2(I)锁遗伝子、およびそれぞれの上流领域を含むCharon4Aベクター (RMS8 NJ13)(2.2k) pGVBα1(I)(4.0k) In this case, the first step is to reduce the number of active substances in the α1(I) lock, and the second step is to reduce the number of active substances in the α2(I) lock. Now, the first part of the list is divided into two parts.