DNAヘリカーゼを用いた哺乳類細胞のDNA複製の研究

使用 DNA 解旋酶研究哺乳动物细胞中的 DNA 复制

• 批准号: 07672347
• 负责人: 榎本 武美
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07672347/
• 关键词: DNAヘリカーゼB; ヘリカーゼモチーフ; RecD; DNA複製; 哺乳類細胞; cell-free DNA複製系

本研究は哺乳類細胞のDNA複製に関与するDNAヘリカーゼを同定し、このヘリカーゼをプローブにして哺乳類細胞のDNA複製を解析することを目的としたものである。我々は、DNA複製の温度感受性変異株を分離し解析することにより、DNAヘリカーゼBがDNA複製に関与するDNAヘリカーゼであることを示唆してきた。本研究で、DNAポリメラーゼα-プライマーゼ複合体のプラーマ-ゼ活性に及ぼすDNAヘリカーゼBの影響を調べたところ、DNAヘリカーゼBがプライマーゼ活性を顕著にすることが観察され、DNAヘリカーゼBが原核細胞やウイルスのDNA複製に関与するDNAヘリカーゼと同様な作用をすることが明らかになった。さらに、cell-freeのDNA複製系を用いて、この系で機能するDNAヘリカーゼを検討したところ、調べた哺乳類細胞のDNAヘリカーゼのうち唯一、DNAヘリカーゼBのみがこの系で機能することが明らかになった。このように、機能の面からも、DNAヘリカーゼBがDNA複製に関与するDNAヘリカーゼであることを示すことができた。さらに、DNAヘリカーゼBのcDNAのクローニングを試み、cDNAの全長をクローニングすることができた。ホモロジー検索の結果、DNAヘリカーゼBは大腸菌のRecD蛋白とホモロジーの高いヘリカーゼモチーフをもつことが明らかになった。このような蛋白の遺伝子が単離されたのは真核細胞では初めてのことである。この遺伝子によりコードされるアミノ酸配列からDNAヘリカーゼBに結合する抗体も作製することができた。今後、このcDNAを用いてtwo-hybrid systemによりDNAヘリカーゼBと相互作用する蛋白を検索したり、作製した抗体を用いることにより、哺乳類細胞のDNA複製機構やその開始機構を解析していく予定である。

The aim of this study is to analyze DNA replication in mammalian cells. The temperature sensitive mutants of DNA replication were isolated and analyzed. In this study, the effects of DNA replication on the activity of DNA in prokaryotic cells were investigated. In addition, cell-free DNA replication system function, DNA replication system function, mammalian cell DNA replication system function, DNA replication system function. This is the first time I've ever seen a DNA clone. The DNA sequence of the cDNA sequence was analyzed.ホモロジー検索の结果、DNAヘリカーゼBは大肠菌のRecD蛋白とホモロジーの高いヘリカーゼモチーフをもつことが明らかになった。The protein gene is isolated from eukaryotic cells. The DNA sequence of this protein was determined by DNA sequencing. In the future, the cDNA will be used in two-hybrid system, DNA replication and interaction, protein detection, antibody production, mammalian DNA replication mechanism and initiation mechanism will be analyzed.

项目成果

Akiko Saitoh: "Stimulation of mouse DNA primase-catalyzed oligoribonucleotide synthesis by mouse DNA helicase B" Nucleic Acids Research. 23. 2014-2018 (1995)

Akiko Saitoh：“通过小鼠 DNA 解旋酶 B 刺激小鼠 DNA 引物酶催化的寡核糖核苷酸合成”核酸研究。

Ken Matsumoto: "Stimulation of DNA synthesis by mouse DNA helicase B in a DNA replication system containing eukaryotic replication origins." Biochemistry. 34. 7913-7922 (1995)

Ken Matsumoto：“在含有真核复制起点的 DNA 复制系统中，小鼠 DNA 解旋酶 B 刺激 DNA 合成。”

Masayuki Seki: "Characterization of DNA synthesis and DNA-dependent ATPase activity at the restrictive temperature in temperature-sensitive mutants, tsFT848 cells with thermolabile DNA helicase B" Molecular and Cellular Biology. 15. 165-172 (1995)

Masayuki Seki：“在温度敏感突变体、具有不耐热 DNA 解旋酶 B 的 tsFT848 细胞中，在限制温度下表征 DNA 合成和 DNA 依赖性 ATP 酶活性”《分子和细胞生物学》。

Toshihiko Eki: "Efficient replication of polyomavirus DNA in a cell-free system supplemented with Escherichia coli single-stranded DNA binding protein, which exhibits species-specificity in" Journal of Biochemistry. 118. 435-441 (1995)

Toshihiko Eki：“在补充有大肠杆菌单链 DNA 结合蛋白的无细胞系统中有效复制多瘤病毒 DNA，该系统在《生物化学杂志》中表现出物种特异性。