DNAヘリカーゼを用いた哺乳類細胞のDNA複製の研究

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本研究は哺乳類細胞のDNA複製に関与するDNAヘリカーゼを同定し、このヘリカーゼをプローブにして哺乳類細胞のDNA複製を解析することを目的としたものである。我々は、DNA複製の温度感受性変異株を分離し解析することにより、DNAヘリカーゼBがDNA複製に関与するDNAヘリカーゼであることを示唆してきた。本研究で、DNAポリメラーゼα-プライマーゼ複合体のプラーマ-ゼ活性に及ぼすDNAヘリカーゼBの影響を調べたところ、DNAヘリカーゼBがプライマーゼ活性を顕著にすることが観察され、DNAヘリカーゼBが原核細胞やウイルスのDNA複製に関与するDNAヘリカーゼと同様な作用をすることが明らかになった。さらに、cell-freeのDNA複製系を用いて、この系で機能するDNAヘリカーゼを検討したところ、調べた哺乳類細胞のDNAヘリカーゼのうち唯一、DNAヘリカーゼBのみがこの系で機能することが明らかになった。このように、機能の面からも、DNAヘリカーゼBがDNA複製に関与するDNAヘリカーゼであることを示すことができた。さらに、DNAヘリカーゼBのcDNAのクローニングを試み、cDNAの全長をクローニングすることができた。ホモロジー検索の結果、DNAヘリカーゼBは大腸菌のRecD蛋白とホモロジーの高いヘリカーゼモチーフをもつことが明らかになった。このような蛋白の遺伝子が単離されたのは真核細胞では初めてのことである。この遺伝子によりコードされるアミノ酸配列からDNAヘリカーゼBに結合する抗体も作製することができた。今後、このcDNAを用いてtwo-hybrid systemによりDNAヘリカーゼBと相互作用する蛋白を検索したり、作製した抗体を用いることにより、哺乳類細胞のDNA複製機構やその開始機構を解析していく予定である。