複数時間ウィンドウでの哺乳類脳操作を実現する薬剤誘導性人工遺伝子スイッチ開発

开发药物诱导的人工基因开关以实​​现多时间窗口的哺乳动物大脑操控

• 批准号: 15H06145
• 负责人: 松山 真
• 金额: $ 1.66万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-08-28 至 2017-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H06145/
• 关键词: 薬剤誘導性人工遺伝子スイッチ; 血液脳関門透過性; 哺乳類脳; ルシフェラーゼアッセイ; レンチウイルスベクター

申請者は哺乳類以外の生物種（細菌、酵母、植物、昆虫、両生類）の遺伝子発現系を基に、複数の薬剤誘導性遺伝子スイッチを作製し、特定の機能に関連する神経細胞集団を時間軸に沿って遺伝学的に切り分ける技術開発を行っている。平成27年度には設計した人工遺伝子発現系の誘導剤の血液脳関門透過性評価、哺乳類培養細胞を用いたルシフェラーゼアッセイによる薬剤誘導性人工遺伝子スイッチの同定、そして実際にラット大脳において遺伝子発現On/Offの検証まで研究を進めた。設計した人工遺伝子発現系を哺乳類中枢神経系に適用するには、目的遺伝子を誘導する化合物（誘導剤）が血液脳関門を十分量通過することが必須である。そのためトランスポーター発現イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来MDR1-MDCK細胞を用いた血液脳関門透過性試験によって、まずはドキシサイクリンを含む10種類の誘導剤からドキシサイクリンと同程度以上の透過性を示す6種類の候補へと絞り込んだ。次に絞り込まれた誘導剤による遺伝子発現系の下流にルシフェラーゼ遺伝子を繋げたプラスミドの構築と、ヒト胎児由来腎臓上皮細胞HEK293T細胞へのトランスフェクション、そして培地に誘導剤を添加した際のルシフェラーゼタンパク質の発現量の測定を行った。大腸菌・真正細菌・カイコガ由来の18種類の人工遺伝子スイッチをアッセイした結果、対応した誘導剤に対して高い遺伝子発現量をもち、かつドキシサイクリンに対して遺伝子発現量変化が十分低い遺伝子スイッチ5種類が選抜された。その5種類の遺伝子スイッチのうち1種類について赤色蛍光タンパク質（mCherry）を誘導剤により発現するレンチウイルスベクターを作製しラット海馬に注入した。誘導剤投与の有無で2群に分けて飼育したところ、非誘導個体では僅かなmCherryの生蛍光が誘導個体でははっきりと組織学的に確認され、1年目にしてまずは１つ有望な人工遺伝子スイッチの作製に成功した。

The applicant is engaged in the technical development of gene generation systems for biological species other than mammals (bacteria, yeast, plants, insects, and mammals), the control of multiple drug-induced gene expression systems, and the analysis of gene expression systems along the Timeline of a neural cell population associated with specific functions. In 2007, we conducted research on the design, identification, and identification of blood and plasma permeability of inducible artificial gene expression systems in mammalian culture cells, as well as On/Off detection of inducible artificial gene expression in mammalian culture cells. Design of artificial gene expression system for mammalian central nervous system application, target gene induction compounds (inducers), blood clots, and a number of other necessary In addition, there are 10 kinds of inducers, 10 kinds of inducers, and 6 kinds of candidates for permeability test in the urine tubule epithelial cells derived from MDR1-MDCK cells. Construction and development of the downstream gene expression system of HEK293T cells derived from fetal kidney, and determination of the production of the downstream gene expression system of HEK293T cells upon addition of the induction agent. Escherichia coli, true bacteria, bacteria, 18 species of artificial genes, the results, the response to the induction agent, the high level of gene expression, the change of gene expression to the very low level of gene expression, 5 species were selected. The five species of cherry have been identified and the first species of cherry has been identified. The induced and non-induced individuals were cultured in two groups, and the non-induced individuals were identified histologically. One year later, the artificial gene was successfully produced.