Characterizafion of gene network in isoquinoline alkaloid biosynthesis and its application

异喹啉生物碱生物合成基因网络特征及其应用

• 批准号: 16208011
• 负责人: SATO Fumihiko
• 金额: $ 31.2万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16208011/
• 关键词: isoquinoline alkaloids; metabolic network; transcriptional regulation; metabolic engineering; transient RNAI; reconstruction of biosynthesis in microbe; 生合成酵素; 転写因子; 代謝プロファイリング; 代謝プロファイリ

1. Isolation and characterization of biosynthetic enzyme genes(1) Identification and characterization of norcoclaurine synthase and tetrahydroberberine oxidase in berberine biosynthesis from Coptis japonica(2) Identification and characterization of corytuberine synthase (CYP80G2) from Coptis japonica in magnoflorine biosynthesis(3) Identification and characterization of stylopine synthase (CYP719A2/A3) from California poppy in sanguinarine biosynthesis2. Metabolic engineering of isoquinoline alkaloid biosynthesis using biosynthetic genes isolated(1) Increase of the isoquinoline alkaloid production by the overexpression of rate-limiting enzyme gene; e.g., overexpression of norcoclaurine 6-O-methyltransferase isolated from Coptis japonica in California poppy cells(2) Accumulation of intermediate by the metabolic block using gene silencing with RNAi technology; e.g., reticuline accumulation in transgenic California poppy cells transformed with RNAi vector for berberine bridge enzyme(3) Pr … More oduction of novel metabolites by the introduction of new branch pathway ; e.g., introduction of scoulerine 9-O- methyltransferase isolated from Coptis japonica in California poppy cells. Modification of metabolite profiles in transgenic cells has been characterized with LC-MS, LC-NMR.(4) Increase of isoquinolie alkaloid accumulation by the overexpression of biosynthetic gene (3'-hydroxy N-methylcoclaurine 4' O-methyltransferase) was determined in transgenic Coptis japonica plants.3. Characterization of transcriptional regulation system in isoquinoline alkaloid biosynthesis(1) Development of novel screening system to isolate transcriptional factor genes using transient RNAi in Coptis japonica protoplasts.(2) Identification of WRKY1 and bHLH1 as the comprehensive gene regulator specific for isoquinoline alkaloid biosynthesis in Coptis japonica cells(3) Isolation of promoter sequences for some biosynthetic genes in isoquinoline alkaloid biosynthesis in Coptis japonica and characterization of promoter activities. Minimum promoter sequences for the expression in Coptis japonica protoplasts were identified.4. Reconstruction of isoquinoline alkaloid biosynthesis in microbe(1) Using isolated biosynthetic genes, isoquinoline alkaloid biosynthetic pathway from dopamine to reticuline was reconstructed in Escherichia coli.(2) Using budding yeast with CYP80G2 gene and above transgenic E. coli, magnoflorine was produced from dopamine Less

1.生物合成酶基因的分离与鉴定(1)黄连小连素生物合成过程中去甲黄藤碱合成酶和四氢黄连素氧化酶的鉴定及特性研究(2)黄连木兰素生物合成过程中块茎碱合成酶(CYP80G2)的鉴定与特性(3)加州罂粟花柱碱合成酶(CYP719A2/A3)在血根碱生物合成中的鉴定与特性利用分离的生物合成基因进行异喹啉生物合成的代谢工程(1)通过限速酶基因的过表达增加异喹啉生物碱的产量；例如，在加州罂粟细胞中过表达从黄连中分离出的去甲黄连6-O-甲基转移酶；(2)利用RNA干扰技术的基因沉默通过代谢阻断积累中间体；例如，在小连素桥酶的RNA i载体转化的转基因加州罂粟细胞中网状积累(3)pr…通过引入新的分支途径更多地产生新的代谢物；例如，在加州罂粟细胞中引入从黄连中分离的Soulerine 9-O-甲基转移酶。用LC-MS、LC-核磁共振表征了转基因细胞中代谢产物的修饰。(4)转基因黄连植株中生物合成基因(3‘-羟基N-甲基椰子碱4’O-甲基转移酶)的过表达增加了异喹啉生物碱的积累。异喹啉生物碱生物合成中转录调控系统的特征(1)利用瞬时RNAi技术分离黄连原生质体转录因子基因的新筛选体系的建立。(2)WRKY1和bHLH1作为黄连细胞异喹啉生物碱生物合成的综合基因调控因子的鉴定(3)黄连异喹啉生物碱生物合成中某些生物合成基因的启动子序列的分离和启动子活性的鉴定。确定了该基因在黄连原生质体中表达的最低启动子序列。异喹啉生物碱在微生物中生物合成的重建(1)利用分离的生物合成基因，在大肠杆菌中重建了从多巴胺到网状碱的异喹啉生物合成途径。(2)利用含有CYP80G2基因的芽生酵母和以上转基因大肠杆菌，从多巴胺合成了木兰素

项目成果

植物におけるRNAi研究(その2)メタボリックプロファイリングと代謝工学

植物RNAi研究（第二部分）代谢谱和代谢工程

• 发表时间: 2005
• 期刊: 化学と生物 (印刷中)
• 作者: Hideo Nakae;Hochul Shin;福崎英一郎 他
• 通讯作者: 福崎英一郎 他

アルカロイドの生産性制御因子

生物碱生产率控制因素

• 发表时间: 2004

イソキノリンアルカロイド生合成系を制御するWRKY転写因子の機能解析

控制异喹啉生物碱生物合成系统的WRKY转录因子的功能分析

• 发表时间: 2006
• 作者: 加藤伸彦;古株靖久;吉田沙由美;大柿麻衣;佐藤文彦
• 通讯作者: 佐藤文彦

オウレンscoulerine9-O-methyltransferase遺伝子を導入したハナビシソウ形質転換細胞におけるイソキノリンアルカロイド合成系代謝改変についての解析

E. scoulerine 9-O-甲基转移酶基因转化细胞中异喹啉生物碱合成系统的代谢修饰分析

• 发表时间: 2007
• 作者: 竹村知也;田村健一;乾貴幸;佐藤文彦
• 通讯作者: 佐藤文彦

イソキノリンアルカロイドを産生するハナビシソウから単離したメチレンジオキシ環形成反応を触媒するP450遺伝子の機能解析

从产生异喹啉生物碱的 P450 基因中分离出催化亚甲二氧基成环反应的 P450 基因的功能分析

• 发表时间: 2007
• 作者: 池澤信博;岩佐衣子;佐藤文彦
• 通讯作者: 佐藤文彦