新規低分子化抗体フラグメントFv-claspの改良とその構造生物学への応用

新型小分子抗体片段Fv-clasp的改进及其在结构生物学中的应用

• 批准号: 17H06839
• 负责人: 有森 貴夫
• 金额: $ 1.75万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2017-08-25 至 2019-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17H06839/
• 关键词: Fv-claspのデザイン改変; SARAHドメインの組み合わせ; 蛋白質; 抗体工学

研究代表者はこれまで，抗体のFv領域（VH，VL）に逆平行のコイルドコイル構造を形成するSARAHドメインを融合することで，二量体構造を安定化させた“Fv-clasp”という新規のフラグメント抗体フォーマットを開発してきた．Fv-claspは従来のフラグメント抗体と比べて，どんな抗体にも適用でき，熱安定性，結晶化能においても非常に優れた性質を有するが，抗体によっては大腸菌による生産効率が極めて悪いものがあることが欠点であった．そこで本研究ではFv-claspのデザインの改良に着手した．従来のFv-claspでは，VHとVLの両者にヒトMst1というタンパク質が持つSARAHドメインの配列を融合していたが，本研究では収率改善を目指し，Mst1に加え，ヒトMst2，ヒトRssf1，ヒトRassf5，ヒトSAV1が持つSARAHドメインの配列の融合を試し，最も安定なFv-claspが得られるSARAHドメインのペアを探索することにした．まず，上記5種のタンパク質由来のSARAHドメインの配列をVHとVLのそれぞれに融合した発現コンストラクトを作製し，全ての組み合わせについて網羅的に，動物細胞によるFv-claspの発現を確認した．その結果，従来のSARAHドメインの組み合わせよりも顕著に発現が良好なSARAHドメインの組み合わせを見出すことに成功した．そこで次に，動物細胞による発現が比較的良好だった複数のペアについて，大腸菌発現系を用いた試料の調製を行ったところ，SARAHドメインの配列を変更しても，従来のFv-claspと同様，いずれも簡単なプロトコルで試料を調製することができ，しかも，動物細胞における発現量と大腸菌発現系における試料の収量が相関することが分かった．これらの結果から，改良版Fv-claspに用いるべき最も良好なSARAHドメインのペアを決定することに成功した．

Research representatives は こ れ ま で, antibody の Fv areas (VH and VL) に inverse parallel の コ イ ル ド コ イ を ル structure form す る SARAH ド メ イ ン を fusion す る こ と で, 2 quantity body structure を stabilization さ せ た "Fv - clasp" と い う new rules の フ ラ グ メ ン ト antibody フ ォ ー マ ッ ト を open 発 し て き た. Fv - clasp は 従 to の フ ラ グ メ ン ト antibody と than べ て, ど ん な antibody に も applicable で き, thermal stability, crystallization can に お い て も very に optimal れ た nature を have す る が, antibody に よ っ て は coliform に よ る producing sharper rate が め て 悪 い も の が あ る こ と が points less で あ っ た. Youdaoplaceholder0 た で で this study で で Fv-clasp デザ デザ デザ <s:1> に に improvement に embarked on た た. 従 to の Fv - clasp で は, VH と VL の struck the に ヒ ト Mst1 と い う タ ン パ ク qualitative が hold つ SARAH ド メ イ ン の match column を fusion し て い た が, this study で は 収 rate improve を refers し, Mst1 に え, ヒ ト Mst2, ヒ ト Rssf1, ヒ ト Rassf5, ヒ ト SAV1 が hold つ SARAH ド メ イ ン の go try を し の fusion, the most も settle な Fv - clasp が have ら れ る SARAH ド メ イ ン の ペ ア を explore す る こ と に し た. ま ず, written five の タ ン パ ク qualitative origin の SARAH ド メ イ ン の match column を VH と VL の そ れ ぞ れ に fusion し た 発 now コ ン ス ト ラ ク ト し the を cropping systems, all て の group み close わ せ に つ い て snare に, animal cells に よ る Fv - clasp の 発 を now confirmed し た. そ の results, 従 の SARAH ド メ イ ン の group み close わ せ よ り も 顕 the に 発 が now good な SARAH ド メ イ ン の group み close わ せ を shows す こ と に successful し た. そ こ で に, animal cells に よ る 発 presently が compare good だ っ た plural の ペ ア に つ い て, coliform 発 practice while department を い た sample line の modulation を っ た と こ ろ, SARAH ド メ イ ン の match column を - more し て も, 従 to の Fv - clasp と with others, い ず れ も Jane 単 な プ ロ ト コ ル で sample を modulation す る こ と が で き, The amount of animal cell における occurrence is と, the amount of escherichia coli occurrence is における, the amount of sample of the test material が is related to する った とが とが った った. こ れ ら の results か ら, modified Fv - clasp に with い る べ き も most good な SARAH ド メ イ ン の ペ ア を decided す る こ と に successful し た.

项目成果

Crystallization and structure determination of laminin-binding integrin α6β1 aided by the use of Fv-clasp technology

利用 Fv-clasp 技术辅助层粘连蛋白结合整合素 α6β1 的结晶和结构测定

• 发表时间: 2017
• 作者: Takao Arimori;Junichi Takagi
• 通讯作者: Junichi Takagi

Fv-clasp: An Artificially Designed Small Antibody Fragment with Improved Production Compatibility, Stability, and Crystallizability

• DOI: 10.1016/j.str.2017.08.011
• 发表时间: 2017-10-03
• 期刊: STRUCTURE
• 影响因子: 5.7
• 作者: Arimori, Takao;Kitago, Yu;Takagi, Junichi
• 通讯作者: Takagi, Junichi