Elucidation of a morphogenic mechanism via Delta-Notch signaling pathway - an in vivo examination of a mathematical prediction on biliary formation

本研究の交付申請段階では、2022年度にNotch2-Gal4VP16融合遺伝子およびウシ成長ホルモンポリA配列を持つプラスミド（Notch2Gal4VP16-bGHpolyAプラスミド）を作製し、同プラスミドを用いて、Notch2遺伝子座エクソン1にCRISPR/Cas9法によりノックインする予定であった。そして、2023年度には、すでに保有する別の二種類の遺伝子組換えマウス（UAS-CreマウスおよびR26GRRマウス）とNotch2-Gal4VP16マウスを交配して得られる、三重遺伝子組換えマウスを組織学的に解析する予定であった。実際、2022年度にはNotch2Gal4VP16-bGHpolyAプラスミドの作製に成功し、direct sequenceによって配列の正確性を確認することができた。しかし他方で、2022年度に実施したENCODE解析では、Notch2遺伝子座エクソン1付近にはプロモーターやエンハンサーと推定される領域が集簇しており、ノックインサイトとしては必ずしも理想的でないことが判明したため、後述するようにノックイン戦略を見直した。なお、本研究では、Notch2受容体シグナルに加えて、Notch1受容体シグナルの組織学的解析が将来的に必要になる可能性が高い。そこで、2022年度には腎臓においてNotch1受容体シグナルの組織学的解析を行い、論文として査読付き国際英文科学雑誌に投稿したほか、第70回日本実験動物学会（2023年5月24日から同26日まで、つくば市にて）で成果を発表予定である。また、すでに保有するNotch1-Gal4VP16マウス、UAS-Creマウス、R26GRRマウスの飼育および交配を通じて、Notch1受容体シグナルが雄性生殖細胞系列に伝達されないことが判明したため、このことについても論文として査読付き国際英文科学雑誌に投稿した。

本研究の交付申請段階では、2022年度にNotch2-Gal4VP16融合遺伝子およびウシ成長ホルモンポリA配列を持つプラスミド（Notch2Gal4VP16-bGHpolyAプラスミド）を作製し、同プラスミドを用いて、Notch2遺伝子座エクソン1にCRISPR/Cas9法によりノックインする予定であった。そして、2023年度には、すでに保有する別の二種類の遺伝子組換えマウス（UAS-CreマウスおよびR26GRRマウス）とNotch2-Gal4VP16マウスを交配して得られる、三重遺伝子組換えマウスを組織学的に解析する予定であった。実際、2022年度にはNotch2Gal4VP16-bGHpolyAプラスミドの作製に成功し、direct sequenceによって配列の正確性を確認することができた。しかし他方で、2022年度に実施したENCODE解析では、Notch2遺伝子座エクソン1付近にはプロモーターやエンハンサーと推定される領域が集簇しており、ノックインサイトとしては必ずしも理想的でないことが判明したため、後述するようにノックイン戦略を見直した。なお、本研究では、Notch2受容体シグナルに加えて、Notch1受容体シグナルの組織学的解析が将来的に必要になる可能性が高い。そこで、2022年度には腎臓においてNotch1受容体シグナルの組織学的解析を行い、論文として査読付き国際英文科学雑誌に投稿したほか、第70回日本実験動物学会（2023年5月24日から同26日まで、つくば市にて）で成果を発表予定である。また、すでに保有するNotch1-Gal4VP16マウス、UAS-Creマウス、R26GRRマウスの飼育および交配を通じて、Notch1受容体シグナルが雄性生殖細胞系列に伝達されないことが判明したため、このことについても論文として査読付き国際英文科学雑誌に投稿した。