Electron microscopic analysis of macular hole after stem cell-derived retinal organoid transplantation

干细胞源性视网膜类器官移植后黄斑裂孔的电镜分析

• 批准号: 22K20968
• 负责人: 秋葉 龍太朗
• 金额: $ 1.33万
• 依托单位: Chiba University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-08-31 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K20968/
• 关键词: 黄斑円孔; 網膜再生; ES細胞; 電子顕微鏡; シナプス; 幹細胞

黄斑円孔は網膜中心部が障害され視力低下をきたす疾患であり、手術によって治療困難な症例が問題となっている。今回の研究で我々はニホンザルの黄斑円孔モデルに対し、ヒトES細胞由来の網膜組織を移植し、円孔閉鎖が可能であるかを検討する。さらに移植後の網膜組織をSerial Blockface Scanning Electron Microscopy (SBFSEM)で撮影し、得られた画像から網膜の神経細胞を三次元再構築およびシナプス解析を行うことで、移植した細胞とホストの網膜がシナプス形成を行い、網膜回路の修復が可能であるかを検討する。研究計画１年目の時点では、共同研究先である神戸アイセンター研究所においてヒトES細胞から分化誘導した網膜組織を作成した。さらに、全身麻酔下の硝子体手術でES細胞由来網膜組織をニホンザルの黄斑円孔眼の黄斑円孔中心部に移植することに成功した。そして移植後半年の時点まで、継続して網膜組織が生着し、黄斑円孔が閉鎖していることを光干渉断層計(OCT)を用いて非侵襲的に確認することに成功した。移植半年後に全身麻酔下で眼球摘出および網膜サンプルの固定を行った。移植後の網膜組織はUniversity of Washingtonに送付し、電子顕微鏡撮影のためのオスミウム染色や脱水、レジンブロック包埋などの前処理を行った上、厚切り切片の光学顕微鏡像を用いて撮影部位を決定し、移植片とホスト網膜黄斑円孔境界部にしぼったサンプルのトリミングを行い、SBFSEM画像撮影に成功した。今後は撮影後の画像を千葉大学において解析する予定である。

The macular hole in the central part of the retina is a problem with low vision and difficult treatment. In this paper, we discuss the possibility of transplantation of retinal tissue from which ES cells originate and the possibility of pore closure. Serial Blockface Scanning Electron Microscopy (SBFSEM) of retinal tissue after transplantation was used to analyze the three-dimensional reconstruction of retinal nerve cells and the possible repair of retinal circuits. Research plan 1 year ago, we jointly studied the development of embryonic stem cells. The ES cells were successfully transplanted into the central part of the macular hole under general anesthesia. Half a year after transplantation, retinal tissue was formed and yellow spots were closed. OCT was used to confirm the success. Half a year after transplantation, the eyeball was extracted and the retina was fixed. After transplantation, the retina tissue was sent to the University of Washington, electron microscope imaging, staining, dehydration, embedding, and pretreatment. The optical microscope imaging of thick section was used to determine the imaging site. The graft was successfully imaged by SBFSEM. The future of Chiba University